• facebook
  • linkedin
  • youtube

1. Detekte absòbe solisyon RNA

Absorbans nan 280, 320, 230, ak 260 nm reprezante valè asid nikleyik, background (solisyon turbidity), konsantrasyon sèl, ak matyè òganik tankou pwoteyin, respektivman.Anjeneral sèlman gade nan OD260/OD280 (Rapò, R).Lè 1.8 ~ 2.0, nou panse ke kontaminasyon an nan pwoteyin oswa lòt matyè òganik nan RNA ka tolere, men li ta dwe remake ke lè yo itilize Tris kòm tanpon pou detekte absòbe a, valè R la ka pi gran pase 2 (jeneralman li ta dwe <2.2).Lè R <1.8, polisyon an nan pwoteyin oswa lòt matyè òganik nan solisyon an se pi evidan, ak sò a nan RNA a ka detèmine selon bezwen yo.Lè R>2.2, sa vle di ke RNA te idrolize nan yon sèl asid nikleyik.
 
2.Modèl elektwoforetik RNA
Anjeneral, jèl denaturasyon yo itilize pou elektwoforèz RNA, men si li se sèlman pou detekte bon jan kalite a nan RNA, jèl denaturasyon pa nesesè, epi yo ka itilize jèl agarose òdinè.Objektif elektwoforèz la se detekte entegrite bann 28S ak 18S ak rapò yo, oswa entegrite fwoti mRNA.Anjeneral, si bann 28S ak 18S yo klere, klè, ak byen file (ki refere a bor yo nan gwoup yo klè), ak klète 28S la se plis pase de fwa nan gwoup la 18S, nou konsidere bon jan kalite a nan RNA a bon.
Pi wo a se de metòd nou itilize souvan, men okenn nan de metòd sa yo pa ka di nou klèman si gen RNase rezidyèl nan solisyon RNA a.Si gen yon ti kantite RNase nan solisyon an, li difisil pou nou detekte li ak metòd ki anwo a, men pi fò nan reyaksyon anzimatik ki vin apre yo te pote soti nan pi wo a 37 degre ak pou yon tan long.Nan fason sa a, si gen yon ti kantite RNase nan solisyon an RNA, Lè sa a, pral gen yon anviwònman trè apwopriye ak tan yo jwe wòl yo nan eksperyans ki vin apre yo, ak nan kou eksperyans la pral frèt nan moman sa a.Anba a nou prezante yon metòd ki ka konfime si gen RNase rezidyèl nan solisyon RNA a.
 
3. Tès prezèvasyon chalè
Dapre echantiyon konsantrasyon an, trase de 1000 ng RNA nan solisyon RNA a epi ajoute li nan yon tib santrifij 0.5 ml, epi konplete li ak pH 7.0 Tris tanpon nan yon volim total de 10 ul, ak Lè sa a, sele bouchon tib la.Mete youn nan yo nan yon beny dlo tanperati konstan nan 70 ° C epi kenbe li cho pou 1 èdtan.Lòt pati a te estoke nan yon frijidè -20 ° C pou 1 èdtan.Lè tan an rive, retire de echantiyon yo pou elektwoforèz.Apre elektwoforèz la fini, konpare gwoup elektwoforèz de la.Si gwoup yo nan de yo konsistan oswa pa gen okenn diferans enpòtan (nan kou, gwoup yo tou satisfè kondisyon yo nan metòd 2), sa vle di ke pa gen okenn kontaminasyon RNase rezidyèl nan solisyon an RNA, ak bon jan kalite a nan RNA a trè bon.Okontrè, si echantiyon an enkube nan 70 ° C montre degradasyon evidan, li endike ke gen kontaminasyon RNase nan solisyon an RNA.
 
2 Metòd eksperimantal ak teknik pou fè ekstraksyon RNA
Pwoblèm nou rankontre souvan lè nou retire RNA yo se: (1) pwodiksyon RNA ba;(2) RNA gen gwo polisyon sèl;(3) RNA gen gwo polisyon sòlvan òganik;(4) echantiyon degradasyon ak lòt pwoblèm
 
1. Souvan itilize reyaktif ekstraksyon RNA total
Metòd guanidine isothiocyanate ak metòd Trizol yo se metòd ki pi souvan itilize pou fè ekstraksyon RNA total nan tisi bèt ak selil bèt yo.Li espesyalman apwopriye pou ti echantiyon ak tisi ki patikilyèman difisil pou ekstrè, tankou ekstraksyon total RNA soti nan po lapen ak tisi konjonktif bèt;nplis de sa, Trizol, kòm yon reyaktif lysis jeneral, kapab tou itilize pou fè ekstraksyon nan tisi plant, bakteri, fongis ak lòt tisi.Pou tisi plant ki gen polisakarid ak polifenol, tankou kamelya oleifera, fèy te, kolza, elatriye, metòd CTAB ka itilize tou pou ekstrè RNA total.

Kòm yon metòd konvansyonèl, metòd la doub-kolòn se tou trè popilè akòz operasyon tanperati nòmal li yo, pa bezwen ajoute RNase, ak sekirite-pa gen klowofòm, fenol ak lòt reyaktif òganik pou fè ekstraksyon.(pwodwi rekòmande )

1
2

2. Ekstraksyon RNA total nan tisi bèt yo
 
(1) Eseye chwazi tisi fre, si li pa fre (de preferans nan twa mwa - 80 ℃ frijidè oswa jele nan nitwojèn likid. Lè koupe tisi, pa koupe dirèkteman nan tanperati chanm, asire w ke ou Mete l sou bwat glas la, eseye evite repete konjelasyon ak dekonjle).
(2) Sèvi ak sizo pwòp ak pensèt pou koupe yon ti moso tisi, eseye koupe pati santral la nan tisi a lè w ap koupe echantiyon an, oswa premye koupe gwo moso tisi a soti nan mitan an, ak Lè sa a, koupe echantiyon an nan pozisyon an ensizyon fre.Tisi yo retire yo ta dwe konplètman graje, mete tisi a graje nan yon tib EP san RNase, ajoute lysate la, tisi a graje yo ta dwe konplètman ekspoze a lysate la, epi prepare pou homogenization.

(3) Pou tisi nòmal, chwazi tisi ki gwosè pwa mung (30-60 mg) pou omojènize.Si tisi yo gen yon gwo kantite pwoteyin, grès, oswa tisi fib dans tankou fwa, yon fason apwopriye ogmante oswa diminye kantite tisi koupe (si ou vle) Chwazi 10 ~ 20 mg).
(4) Si misk pwason, vyann kribich, fosilize yo ak lòt tisi ki gen gwo kontni dlo yo ekstrè, yo ta dwe ogmante volim echantiyon an kòmsadwa (rekòmande 100-200 mg).
(5) Si kondisyon yo pèmèt, tisi bèt la ka dirèkteman ekstrè apre yo fin omojeneize ak yon omojènize tisi segondè-pasaj, si pa gen okenn ekipman sa yo.
(6) RNA ki te jwenn apre ekstraksyon final la dwe mete sou bwat glas la imedyatman pou diminye degradasyon RNA.

3. Ekstraksyon RNA selil bèt

(1) Selil sispansyon: santrifuje dirèkteman epi jete mwayen an, lave ak PBS esteril pou 1-2 fwa, Lè sa a, sispann ak yon kantite apwopriye nan PBS, ak Lè sa a, ajoute lysate pou lysis.Pa ajoute lysate la dirèkteman nan selil presipite yo apre yo fin jete likid la nèt.Sa a pral lakòz pake histon lage apre selil yo lysed sou kouch ekstèn nan konfòme yo ak deyò nan selil yo presipite, kidonk limite kontak la nan selil yo andedan granules la ak lysate la., sa ki lakòz liz selil enkonplè ak redwi sede RNA.

(2) Selil ki semi-aderan oswa ki pa byen aderan: Apre jete mwayen an, lave ak PBS pou 1-2 fwa, Lè sa a, dirèkteman absòbe yon kantite apwopriye nan PBS epi soufle plat kilti a ak yon pipèt oswa zam soufle selil yo, epi transfere yo nan selil RNA-gratis.Ajoute lysate la nan tib EP anzim la pou fè ekstraksyon.

(3) Selil aderan yo: bezwen dijere ak tripsin an premye, answit kolekte nan tib EP ki pa gen RNase, santrifuje pou retire supernatant la, lave 1-2 fwa ak PBS pou retire depase tripsin, epi resesann ak yon kantite apwopriye PBS Lè sa a, kontinye nan etap ekstraksyon an.

4. Plant RNA ekstraksyon

Tisi plant yo rich nan konpoze fenolik, oswa rich nan polisakarid, oswa gen kèk metabolit segondè ki pa idantifye, oswa gen gwo aktivite nan RNase.Sibstans sa yo byen konbine avèk RNA apre liz selil yo pou fòme konplèks ensolubl oswa presipitasyon koloidal, ki difisil pou retire.Se poutèt sa, lè nou ekstrè tisi plant, nou bezwen chwazi yon twous pou plant yo.Lysate nan twous la ka efektivman rezoud pwoblèm yo nan oksidasyon fasil nan polifenol ak separasyon nan konpoze polisakarid ak asid nikleyik.

(Pou ekstraksyon RNA plant polisakarid polifenol, pwodwi rekòmande:

(1) Kale, kaka, grenn, fèy, elatriye nan plant la ta dwe konplètman mouye nan yon mòtye.Pandan pwosesis la fanm k'ap pile, nitwojèn likid yo ta dwe ranplir nan tan pou fè pou evite fonn echantiyon an.Yo ta dwe ajoute echantiyon tè a byen vit nan lysate la epi souke pou evite degradasyon RNA.

(2) Pou echantiyon ki rich nan fib tankou diri ak fèy ble, kantite ekstraksyon yo ta dwe redwi kòmsadwa, otreman fanm k'ap pile tisi a ak lysis pa pral konplè, sa ki lakòz yon sede ba nan ekstrè RNA.

(3) Pou tisi plant ki gen gwo kontni dlo, tankou fwi grenad, fwi melon, fwi pèch, elatriye, gwosè echantiyon an ta dwe kòmsadwa ogmante (100-200 mg se opsyonèl).

(4) Tisi plant yo, tankou fèy plant, rizom, fwi difisil ak lòt materyèl yo jeneralman rekòmande pou itilize nitwojèn likid pou byen mòtye engredyan yo nan yon mòtye, ak Lè sa a, kontinye nan etap ekstraksyon an.Homogenizers tisi konvansyonèl yo ka pa efikas nan omojèn tisi plant yo, epi yo jeneralman yo pa rekòmande.

5. Prekosyon pou fè ekstraksyon RNA

(1) Echantiyon tisi yo ta dwe fre ke posib pou evite konjelasyon repete ak dekonjle.

(2) Tisi a ta dwe konplètman tè pandan ekstraksyon, ak kantite tisi a pa ta dwe twò piti, se pou kont li twòp.

(3) Yo ta dwe bay ase tan enkubasyon apre yo fin ajoute lisat la pou lise echantiyon an konplètman.

(4) Lè w ap itilize metòd Trizol la pou fè ekstraksyon, prensip absòbe supernatant la apre stratifikasyon se "pito respire mwens pase respire plis", epi li pa dwe ekstrè nan kouch mitan an, otreman li pral lakòz kontaminasyon ADN genomik grav.

(5) Lè w ap lave, likid lave a ta dwe konplètman enfiltre alantou miray tib la pou asire bon jan lave.

(6) Pou metòd ekstraksyon kolòn lan, anplis detache kolòn nan apre lave, kolòn adsorption yo ta dwe mete tou nan yon ban ultra-pwòp epi kònen pou 5-10 minit pou konplètman evapore sòlvan òganik la nan sechrès.

(7) Nan dènye elisyon metòd kolòn lan, apre yo fin ajoute dlo DEPC, li ta dwe enkube pou 3-5 minit, oswa dlo DEPC yo ta dwe chofe a 60 ° C davans pou ogmante sede elisyon an.Nan tradisyonèl Trizol klivaj ak izopropanol presipitasyon metòd, RNA final la fonn nan dlo DEPC, kidonk yo ta dwe bay yon tan apwopriye pou yap divòse, epi anba tib santrifij la ta dwe kontinyèlman kònen ak yon pwent pipèt.

3 Theree Kòz ak solisyon pou konsantrasyon RNA ki ba / bon jan kalite pòv
 
1. Sede a twò ba
Echantiyon ekstrè a twò ba, kantite total la ensifizan, oswa echantiyon ekstrè a twòp epi liz la pa konplè;yo ta dwe itilize tisi a oswa selil ki gen bon jan kalite apwopriye pou fè ekstraksyon, pre-tretman echantiyon an dwe fè byen, epi liz la ta dwe ase.
 
2. Résidus genòm
Lè èkstraksyon pa metòd Trizol, lè supernatant la aspire nan kouch mitan an apre kouch, kontaminasyon genomic grav pral lakòz;atansyon siplemantè yo ta dwe pran lè kouch pou evite souse nan kouch mitan an.Si yo itilize metòd kolòn pou fè ekstraksyon, yo ka chwazi yon twous ki gen DNase I pou fè ekstraksyon.Se asid nikleyik adsorbed sou manbràn an dirèkteman dijere ak DNase I, ki ka redwi anpil résidus ADN.
 
3. RNA degradasyon
Li ka degradasyon nan echantiyon an ekstrè tèt li, oswa degradasyon an ki te koze pandan pwosesis ekstraksyon an;osi lwen ke posib, echantiyon fre yo ta dwe itilize pou fè ekstraksyon RNA, ak echantiyon yo kolekte yo ta dwe estoke nan nitwojèn likid oswa -80 ° C frijidè nan tan, ak repete konjelasyon ak dekonjle yo ta dwe evite.Konsèy RNase/DNase gratis, tib santrifujeur ak lòt materyèl yo ta dwe itilize nan pwosesis ekstraksyon RNA a.Pwosesis ekstraksyon an ta dwe pi vit ke posib.Yo ta dwe mete RNA a ekstrè sou yon bwat glas epi estoke nan -80 nan tan.Si RNA ekstrè a bezwen detekte pa elektwoforèz jèl, elektwoforèz yo ta dwe fèt imedyatman apre ekstraksyon, epi tanpon elektwoforèz la ta dwe ranplase ak yon sèl ki fèk prepare.
 
4. Sèl ak òganik sòlvan résidus
Reyaktif ekstraksyon yo gen fenol ak sèl guanidine, ak solisyon lave a gen etanòl.Pandan pwosesis ekstraksyon an, lysate la pa te konplètman absòbe ak jete, epi solisyon an lave pa te fin chèch nèt.Sèl rezidyèl ak solvang òganik yo danjere nan transkripsyon ranvèse ki vin apre ak PCR.Diferan degre anpèchman, kidonk lisate tisi a ta dwe konplètman retire pandan pwosesis ekstraksyon an, ak lave a ta dwe ase pou mi yo ki antoure nan tib la ka lave.Anplis de sa, tib la vide ak kònen se yon etap nesesè, ki pral plis diminye rezidi nan matyè òganik.
 
Pou plis enfòmasyon sou ekstraksyon RNA, tanpri swiv sit entènèt nou an:
www.foreivd.com pou plis enfòmasyon.

7

Lè poste: Dec-01-2022