Prensipal konsepsyon baz (99% pwoblèm yo ka rezoud)
1. Longè Primer: Liv la mande pou 15-30bp, anjeneral sou 20bp.Kondisyon aktyèl la se pi bon yo dwe 18-24bp asire spesifik la, men pi long la pi bon an, Jadendanfan twò lontan ap diminye tou espesifik, epi redwi sede a.
2. Jadendantè anplifikasyon span: 200-500bp apwopriye, epi fragman an ka elaji a 10kb nan kondisyon espesifik.
3. Primer baz: Kontni G + C ta dwe 40-60%, twò piti G + C efè anplifikasyon pa bon, twòp G + C fasil pou parèt bann ki pa espesifik.ATGC pi byen distribye owaza, evite grap ki gen plis pase 5 nukleotid purin oswa pirimidin.Multi-gc pou fen 5 'ak sekans entèmedyè pou ogmante estabilite, evite GC rich nan fen 3', pa gen GC pou 3 dènye baz yo, oswa pa gen GC pou 3 nan 5 dènye baz yo.
4. Evite estrikti segondè nan primè, epi evite konplemantasyon ant de primè, espesyalman konpleman nan fen 3 ', otreman primè dimer yo pral fòme ak bann ki pa espesifik anplifye yo pral pwodwi.
5. Baz yo nan fen 3 'nan primè yo, espesyalman dènye ak penultyèm baz yo, yo ta dwe estrikteman pè pou fè pou evite echèk PCR akòz baz tèminal ki pa pè.
6. Primè yo gen oswa yo ka ajoute ak sit klivaj ki apwopriye yo, ak sekans sib anplifye a ta dwe de preferans gen sit klivaj ki apwopriye, ki trè benefik pou analiz klivaj oswa klonaj molekilè.
7. Espesifik nan primè: primè pa ta dwe gen okenn omoloji evidan ak lòt sekans nan baz done a sekans asid nikleyik.
8. Aprann sèvi ak lojisyèl: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Konsepsyon sou entènèt sa a pi byen).
Kontni ki pi wo a ka rezoud omwen 99% nan pwoblèm konsepsyon Jadendanfan.
Kontwole detay yo nan konsepsyon Jadendanfan
1. Longè Primer
Longè Jadendanfan jeneral se 18 ~ 30 baz.An jeneral, faktè ki pi enpòtan pou detèmine tanperati rkwir Jadendanfan an se longè Jadendanfan an.Tanperati rkwir Jadendanfan an jeneralman chwazi (valè Tm -5 ℃), ak kèk dirèkteman itilize valè Tm.Fòmil sa yo ka itilize pou apeprè kalkile tanperati rkwir primè yo.
Lè longè Jadendanfan an mwens pase 20bp: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Lè longè Jadendanfan an pi gran pase 20bp: 62.3 ℃ + 0.41 ℃ (% GC) -500 / longè-5 ℃
Anplis de sa, anpil lojisyèl ka itilize tou pou kalkile tanperati a recuit, prensip kalkil la pral diferan, kidonk pafwa valè kalkile a ka gen yon ti espas.Pou optimize reyaksyon PCR yo, yo itilize primè ki pi kout ki asire tanperati rkwi pa mwens pase 54 ℃ pou pi bon efikasite ak espesifik.
An jeneral, espesifikite primè ogmante pa yon faktè kat pou chak nukleotid adisyonèl, se konsa ke longè minimòm primè pou pifò aplikasyon yo se 18 nukleotid.Limit siperyè longè Jadendanfan an pa trè enpòtan, sitou ki gen rapò ak efikasite reyaksyon.Akòz entropi, plis Jadendanfan an pi long, se pi ba pousantaj li anile pou li mare ak ADN sib la pou fòme yon modèl ki estab doub-chaj pou ADN polymerase mare.
Lè w ap itilize lojisyèl pou konsepsyon primè, yo ka detèmine longè primè yo pa valè TM nan vire, espesyalman pou primè nan PCR quantitative fluoresans, TM = 60 ℃ oswa konsa yo ta dwe kontwole.
2.GC kontni
Anjeneral, kontni G + C nan sekans Jadendanfan se 40% ~ 60%, ak kontni GC ak valè Tm nan yon pè primè yo ta dwe kowòdone.Si Jadendanfan an gen yon tandans grav GC oswa AT, kantite apwopriye A, T oswa G ak C ke yo ka ajoute nan fen 5 'nan Jadendanfan an.
3. Tanperati recuit
Tanperati rkwit la ta dwe 5 ℃ pi ba pase tanperati dechaj la.Si kantite baz Jadendanfan piti, tanperati a annealing ka ogmante yon fason ki apwopriye, sa ki ka ogmante espesifik PCR la.Si kantite baz yo gwo, tanperati rkwit la ka redwi kòmsadwa.Diferans tanperati rkwir ant yon pè primè nan 4 ℃ ~ 6 ℃ pa pral afekte rannman PCR la, men depreferans tanperati a rkwit nan yon pè primè se menm bagay la, ki ka varye ant 55 ℃ ~ 75 ℃.
4. Evite zòn estrikti segondè nan modèl anplifikasyon an
Li pi bon pou evite rejyon estrikti segondè modèl la lè w ap chwazi fragman anplifye a.Ka estrikti segondè ki estab nan fragman sib la ka prevwa ak estime pa lojisyèl òdinatè ki enpòtan, ki se itil pou seleksyon modèl.Rezilta eksperimantal yo montre ke ekspansyon an souvan san siksè lè enèji gratis (△G) nan rejyon an yo dwe elaji se mwens pase 58.6lkJ/mol.
5. Diferans ak ADN sib
Lè sekans ADN sib anplifye a gwo, yon premye ka mare nan plizyè pati nan ADN sib la, sa ki lakòz plizyè gwoup parèt nan rezilta a.Fwa sa a, li nesesè pou itilize tès lojisyèl BLAST, sit entènèt:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Chwazi Aliman de sekans (bl2seq).
Kole sekans primè nan zòn 1 ak sekans ADN sib nan zòn 2 ka ranplase, epi BLAST kalkile posiblite konplemantè, anti-sans, ak lòt, kidonk itilizatè yo pa bezwen remake si tou de chèn yo se chenn sans.Ou kapab tou antre nimewo GI a si w konnen nimewo GI sekans lan nan baz done a, konsa ou pa bezwen kole yon gwo seksyon nan sekans lan.Finalman, klike sou Aliman nan 3 pou wè si Jadendanfan an gen plizyè sit omològ nan ADN sib la.
6. Primer tèminal
Fen 3 'nan Jadendanfan an se kote ekstansyon an kòmanse, kidonk li enpòtan pou anpeche dezakò kòmanse la.Fen nan 3 'pa ta dwe plis pase 3 youn apre lòt G oswa C, paske sa a pral lakòz Jadendanfan an dwe erè deklanche nan rejyon an sekans anrichisman G + C.Fen 3 'pa ka fòme okenn estrikti segondè, eksepte nan reyaksyon espesyal PCR (AS-PCR), fen 3' nan Jadendanfan an pa ka depamande.Pou egzanp, si rejyon an kodaj anplifye, fen 3 'nan Jadendanfan pa ta dwe sispann nan pozisyon nan twazyèm nan kodon, paske pozisyon nan twazyèm nan kodon se tendans dejenere, ki pral afekte espesifik ak efikasite nan anplifikasyon.Lè w ap itilize primè anèks, al gade nan tablo itilizasyon kodon, peye atansyon sou preferans byolojik, pa sèvi ak primè anèks nan fen 3′, epi sèvi ak yon konsantrasyon ki pi wo nan primè (1uM-3uM).
7. Segondè estrikti primè
Jadendanfan yo tèt yo pa ta dwe gen sekans konplemantè, otreman primè yo tèt yo pral pliye nan estrikti epengl, ak estrikti segondè sa a pral afekte obligatwa nan primè ak modèl akòz antrav esterik.Si yo itilize jijman atifisyèl, baz konplemantè kontinyèl yo nan primè tèt yo pa ta dwe pi gran pase 3bp.Pa ta dwe gen okenn konplemantasyon ant de primè yo, espesyalman sipèpoze konplemantè nan fen 3 'yo ta dwe evite yo anpeche fòmasyon nan dimers Jadendanfan.An jeneral, pa ta dwe gen plis pase 4 baz konsekitif omoloji oswa konplemantè ant yon pè primè.
8. Ajoute makè oswa loci
5 'Fen an gen ti efè sou spesifik anplifikasyon ak Se poutèt sa ka modifye san yo pa afekte spesifik anplifikasyon.Modifikasyon nan jadendanfan 5 'fen enkli: ajoute sit restriksyon anzim;Ki make biotin, fliyoresans, digoxin, Eu3+, elatriye Entwodwi sekans ADN ki lye nan pwoteyin;Entwodwi sit mitasyon, mete ak manke sekans mitasyon ak entwodwi sekans pwomotè, elatriye baz siplemantè yo pral plis oswa mwens afekte efikasite nan anplifikasyon ak ogmante chans pou fòmasyon dimè Jadendanfan, men gen kèk konsesyon yo dwe fè pou pwochen etap la.Sekans adisyonèl ki pa egziste sou sekans sib la, tankou sit restriksyon ak sekans pwomotè, ka ajoute nan fen 5′ nan Jadendanfan an san yo pa afekte espesifik.Sekans sa yo pa enkli nan kalkil valè primè Tm, men yo ta dwe teste pou konplemantè ak estrikti segondè entèn yo.
9. Subclones
Pifò nan tan an, PCR se sèlman klonaj preliminè, ak Lè sa a, nou bezwen subklone fragman sib la nan divès vektè, kidonk nou bezwen konsepsyon baz adisyonèl pou pwochen operasyon an nan etap PCR la.
Gen kèk sekans ki fèt pou subklonaj yo rezime anba a.
Yo te ajoute sit restriksyon endonukleaz restriksyon
Ajoute sit restriksyon anzim yo se metòd ki pi souvan itilize pou subklonaj pwodwi PCR.Anjeneral, sit la klivaj se sis baz, nan adisyon a 5 'fen sit la klivaj bezwen ajoute 2 ~ 3 baz pwoteksyon.Sepandan, kantite baz pwoteksyon ki nesesè pa diferan anzim diferan.Pa egzanp, SalⅠ mande pou pa gen baz pwoteksyon, EcoRⅤ mande pou 1 baz pwoteksyon, NotⅠ mande pou 2 baz pwoteksyon, ak Hind Ⅲ mande pou 3 baz pwoteksyon.
LIC ajoute ke a
Non konplè LIC se klonaj Ligation-Independent, yon metòd klonaj Navogen envante espesyalman pou pati li nan vektè pET la.PET konpayi asirans lan prepare pa metòd LIC gen 12-15 baz sèl ki pa konplemantè bout kolan, ki konplete pwent kolan korespondan yo sou fragman an insert sib.Pou rezon anplifikasyon, sekans premye 5′ fragman ki mete a ta dwe konplete vektè LIC la.Aktivite extranect 3′→5′ T4 DNA polymerase ka fòme yon sèl bout kolan sou fragman ki mete a apre yon ti tan.Paske pwodwi a ka sèlman fòme nan rkwir mityèl nan fragman an insert prepare ak vektè a, metòd sa a se trè vit ak efikas, epi li se dirije klonaj.
Dirije TA script ajoute ke
Klonaj TA pa t 'kapab vize fragman an nan yon vektè, kidonk pita Invitrogen te prezante yon vektè ki ta ka vize klonaj, ki gen kat GTGGS baz enpòtan nan yon bout.Se poutèt sa, nan desen an nan premye PCR, yo ta dwe ajoute sekans konplemantè kòmsadwa, pou ke fragman yo ka "oryante".
Si w kout sou tan, ou ka eseye sentèz dirèk, konbine jèn nan ak vektè a, ki se sa nou rele sentèz jèn ET nan mizekulèr.
D. Metòd klonaj nan-Fizyon
Pa gen okenn ligaz obligatwa, pa gen okenn reyaksyon long obligatwa.Osi lontan ke yo prezante yon sekans nan tou de bout vektè linearize a. Nan desen an premye, Lè sa a, pwodwi PCR ak vektè linearize yo ajoute nan solisyon anzim nan fizyon ki gen BSA epi mete yo nan tanperati chanm pou demi èdtan, transfòmasyon an ka fèt.Metòd sa a se patikilyèman apwopriye pou konvèsyon gwo volim.
10. Fizyone Jadendanfan
Pafwa, se sèlman enfòmasyon limite sekans konnen sou konsepsyon primè.Pou egzanp, si se sèlman sekans asid amine yo li te ye, yo ka fèt Jadendanfan fizyon an.Yon primè fizyon se yon melanj de sekans diferan ki reprezante tout posiblite baz diferan ki kode yon sèl asid amine.Pou ogmante espesifik, ou ka fè referans a tab itilizasyon kodon pou redwi anèks selon preferans itilizasyon baz diferan òganis yo.Hypoxanthine ka asosye ak tout baz pou redwi tanperati recuit Jadendanfan an.Pa sèvi ak baz ki anèks yo nan fen 3′ primè a paske rkwir 3 dènye baz yo nan fen 3′ sifi pou kòmanse PCR nan move sit la.Pi wo konsantrasyon Jadendanfan (1μM a 3μM) yo itilize paske primè nan anpil melanj aneksyon yo pa espesifik nan modèl sib la.
PCR matyè premyèkontwòl
1. Primer kantite
Konsantrasyon chak jadendanfan se 0.1 ~ 1umol oswa 10 ~ 100pmol.Li pi bon pou pwodwi rezilta ki nesesè yo ak kantite lajan ki pi ba nan Jadendanfan.Segondè konsantrasyon nan primè pral lakòz dezakò ak anplifikasyon ki pa espesifik, epi ogmante chans pou fòme dimè ant primè yo.
2. Konsantrasyon Primer
Konsantrasyon nan primè afekte espesifik la.Pi bon konsantrasyon primè se jeneralman ant 0.1 ak 0.5μM.Pi wo konsantrasyon Jadendanfan mennen nan anplifikasyon nan pwodwi ki pa espesifik.
3. Tanperati recuit de Jadendanfan
Yon lòt paramèt enpòtan pou primè se tanperati k ap fonn (Tm).Sa a se tanperati a lè 50% nan primè yo ak sekans konplemantè yo reprezante kòm molekil ADN doub.Tm oblije mete PCR recuit tanperati.Idealman, tanperati rkwit la ba ase pou asire rkwit efikas nan primè yo ak sekans sib la, men ase wo pou diminye obligatwa ki pa espesifik.Tanperati rkwit rezonab soti nan 55 ℃ a 70 ℃.Tanperati rkwit jeneralman mete 5 ℃ pi ba pase Tm nan jadendanfan.
Gen plizyè fòmil pou mete Tm, ki varye anpil selon fòmil yo itilize a ak sekans primè yo.Paske pifò fòmil yo bay yon valè estime Tm, tout tanperati rkwir yo se sèlman yon pwen depa.Espesifik yo ka amelyore lè yo analize plizyè reyaksyon ki pwogresivman ogmante tanperati a recuit.Kòmanse anba a estime Tm-5 ℃, epi piti piti ogmante tanperati a annealing nan yon ogmantasyon de 2 ℃.Tanperati rkwit ki pi wo ap diminye fòmasyon dimers Jadendanfan ak pwodwi ki pa espesifik.Pou pi bon rezilta, de primè yo ta dwe gen valè Tm apwoksimatif.Si diferans Tm nan pè Jadendanfan se plis pase 5 ℃, Jadendanfan yo pral montre yon siyifikatif fo kòmanse lè yo itilize yon tanperati rkwir pi ba nan sik la.Si de premye Tm yo diferan, mete tanperati rkwit la a 5 ℃ pi ba pase Tm ki pi ba a.Altènativman, pou ogmante espesifik, senk sik ka fèt an premye nan tanperati rkwir ki fèt pou pi wo Tm, ki te swiv pa sik ki rete yo nan tanperati rkwir ki fèt pou pi ba Tm.Sa a pèmèt yo jwenn yon kopi pasyèl nan modèl destinasyon an nan kondisyon sere.
4. Premye pite ak estabilite
Pite estanda nan premye koutim adekwat pou pifò aplikasyon PCR.Retire nan gwoup benzoyl ak isobutylyl pa desalting se minim epi Se poutèt sa pa entèfere ak PCR.Gen kèk aplikasyon ki mande pou pirifye pou retire nenpòt sekans ki pa plen longè nan pwosesis sentèz la.Sa yo sekans twonke rive paske efikasite nan chimi sentèz ADN se pa 100%.Sa a se yon pwosesis sikilè ki sèvi ak reyaksyon chimik repete kòm chak baz yo ajoute pou fè ADN soti nan 3′ a 5′.Ou ka echwe nan swa sik.Jadendanfan ki pi long, espesyalman sa yo ki pi gran pase 50 baz, gen yon gwo pwopòsyon nan sekans tronke epi yo ka mande pou pirifye.
Se sede a nan primè ki afekte nan efikasite nan chimi sentetik ak metòd pou pirifye.Konpayi biopharmaceutique, tankou Sitoloji ak Shengong, tout itilize yon inite OD minimòm pou asire pwodiksyon total oligonukleozid.Koutim primè yo anbake nan fòm poud sèk.Li pi bon pou refonn primè yo nan TE pou konsantrasyon final la se 100μM.TE pi bon pase dlo deyonize paske pH dlo a souvan asid epi li pral lakòz idroliz oligonukleozid.
Estabilite nan primè depann sou kondisyon depo.Poud sèk ak primè ki fonn yo ta dwe estoke nan -20 ℃.Jadendantè ki fonn nan TE nan konsantrasyon ki pi gran pase 10μM ka estoke estab nan -20 ℃ pou 6 mwa, men yo ka sèlman estoke nan tanperati chanm (15 ℃ a 30 ℃) pou mwens pase 1 semèn.Premye poud sèk yo ka estoke nan -20 C pou omwen 1 ane ak nan tanperati chanm (15 C a 30 C) pou jiska 2 mwa.
5. Anzim ak konsantrasyon yo
Kounye a, Taq DNA polymerase itilize se fondamantalman anzim jeni jenetik sentèz pa bakteri kolifòm.Kantite anzim ki nesesè pou katalize yon reyaksyon PCR tipik se apeprè 2.5U (refere a volim reyaksyon total 100ul).Si konsantrasyon an twò wo, li ka mennen nan anplifikasyon ki pa espesifik;si konsantrasyon an twò ba, kantite pwodwi sentetik ap redwi.
6. Kalite ak konsantrasyon dNTP
Bon jan kalite a nan dNTP se pre relasyon ak konsantrasyon an ak efikasite nan anplifikasyon PCR.Poud dNTP a granulaire, ak varyasyon li pèdi aktivite byolojik li si li mal estoke.Solisyon dNTP se asid, epi yo ta dwe itilize nan gwo konsantrasyon, ak 1M NaOH oswa 1M Tris.HCL solisyon tanpon ajiste PH li a 7.0 ~ 7.5, ti kantite sub-anbalaj, depo nan frizè nan -20 ℃.Plizyè friz-dekonjle pral degrade dNTP.Nan reyaksyon PCR, dNTP ta dwe 50 ~ 200umol / L.Espesyalman, yo ta dwe peye atansyon sou konsantrasyon nan kat DNTPS yo ta dwe egal (egal preparasyon mòl).Si konsantrasyon nenpòt youn nan yo diferan de lòt yo (pi wo oswa pi ba), dezakò ap lakòz.Twò ba konsantrasyon ap diminye pwodiksyon an nan pwodwi PCR.dNTP ka konbine avèk Mg2 + epi redwi konsantrasyon Mg2 + gratis.
7. Modèl (jèn sib) asid nikleyik
Kantite ak degre pirifikasyon modèl asid nikleyik se youn nan lyen kle pou siksè oswa echèk PCR.Metòd tradisyonèl pou pirifye ADN yo anjeneral itilize SDS ak proteaz K pou dijere epi jete espesimèn yo.Fonksyon prensipal yo nan SDS yo se: fonn lipid ak pwoteyin sou manbràn selilè a, kidonk detwi manbràn selilè a pa fonn pwoteyin manbràn, ak disoye pwoteyin nikleyè nan selil la, SDS ka konbine tou ak pwoteyin ak presipite;Proteaz K ka idrolize ak dijere pwoteyin, espesyalman histones ki mare ak ADN, ak Lè sa a, sèvi ak fenol sòlvan òganik ak klowofòr pou ekstrè pwoteyin ak lòt konpozan selilè, epi sèvi ak etanòl oswa alkòl izopropil pou presipite asid nikleyik.Ka asid nikleyik ekstrè a dwe itilize kòm yon modèl pou reyaksyon PCR.Pou espesimèn deteksyon klinik jeneral, yo ka itilize yon metòd rapid ak senp pou fonn selil, lisate patojèn, dijere epi retire pwoteyin nan kwomozòm pou gratis jèn sib, epi yo itilize dirèkteman pou anplifikasyon PCR.Ekstraksyon modèl RNA anjeneral itilize metòd guanidine isothiocyanate oswa proteaz K pou anpeche RNase degrade RNA.
8.Mg2+ konsantrasyon
Mg2 + gen yon efè enpòtan sou espesifik ak pwodiksyon anplifikasyon PCR.An jeneral reyaksyon PCR, lè konsantrasyon divès kalite dNTP se 200umol/L, konsantrasyon apwopriye Mg2+ se 1.5 ~ 2.0mmol/L.Konsantrasyon Mg2 + twò wo, espesifik reyaksyon an diminye, anplifikasyon ki pa espesifik rive, konsantrasyon twò ba ap diminye aktivite Taq DNA polymerase, sa ki lakòz rediksyon nan pwodwi reyaksyon.
Iyon Manyezyòm afekte plizyè aspè nan PCR, tankou aktivite ADN polymerase, ki afekte sede;Yon lòt egzanp se annealing Jadendanfan, ki afekte espesifik.dNTP ak modèl mare nan ion mayezyòm, diminye kantite ion mayezyòm gratis ki nesesè pou aktivite anzim.Pi bon konsantrasyon ion mayezyòm varye pou diferan pè Jadendanfan ak modèl, men yon PCR tipik kòmanse konsantrasyon ak 200μM dNTP se 1.5mM (nòt: Pou PCR quantitative an tan reyèl, sèvi ak 3 a 5mM solisyon ion mayezyòm ak yon pwofonde fliyoresan).Pi wo konsantrasyon nan iyon mayezyòm gratis ogmante sede, men tou, ogmante anplifikasyon ki pa espesifik ak diminye fidelite.Pou detèmine konsantrasyon pi bon an, titrasyon ion mayezyòm yo te fèt an ogmantasyon de 0.5mM soti nan 1mM a 3mM.Pou diminye depandans sou optimize ion mayezyòm, yo ka itilize Platinum Taq DNA polymerase.Platinum Taq DNA polymerase kapab kenbe fonksyon sou yon seri pi laj de konsantrasyon ion mayezyòm pase Taq DNA polymerase epi kidonk li mande mwens optimize.
9. Pcr-pwomosyon aditif
Optimizasyon tanperati rkwit, konsepsyon primè, ak konsantrasyon ion mayezyòm ase pou anplifikasyon trè espesifik nan pifò modèl;sepandan, kèk modèl, tankou sa yo ki gen gwo kontni GC, mande pou mezi adisyonèl.Aditif ki afekte tanperati k ap fonn ADN bay yon lòt fason pou amelyore espesifikasyon pwodwi ak sede.Denaturasyon konplè modèl la obligatwa pou pi bon rezilta.
Anplis de sa, estrikti segondè a anpeche lyezon Jadendanfan ak ekstansyon anzim.
Aditif PCR, ki gen ladan formamid, DMSO, gliserin, betaine, ak PCRx Enhancer Solution, amelyore anplifikasyon.Mekanis posib yo se diminye tanperati a k ap fonn, kidonk ede rkwir primè yo epi ede ekstansyon ADN polymerase nan rejyon estrikti segondè a.Solisyon PCRx gen lòt avantaj.Optimizasyon iyon mayezyòm minimòm obligatwa lè yo itilize ak Platinum Taq DNA polymerase ak Platinum Pfx DNA polymerase.Se konsa, teknik la Platinum konbine avèk aditif la ogmante espesifik pandan y ap diminye depandans nan twazyèm apwòch la, optimize ion mayezyòm.Pou pi bon rezilta, yo ta dwe optimize konsantrasyon aditif yo, espesyalman DMSO, formamid, ak gliserin, ki anpeche Taq DNA polymerase.
10. Cho kòmanse
Hot start PCR se youn nan metòd ki pi enpòtan pou amelyore espesifik PCR anplis bon konsepsyon Jadendanfan.Malgre ke tanperati optimal elongasyon Taq DNA polymerase se 72 ℃, polymerase a rete aktif nan tanperati chanm.Kidonk, pwodwi ki pa espesifik yo pwodui lè tanperati kenbe pi ba pase tanperati annealing pandan preparasyon reyaksyon PCR la ak nan kòmansman sik tèmik la.Yon fwa fòme, pwodwi sa yo ki pa espesifik yo efektivman anplifye.Hot-start PCR se patikilyèman efikas lè sit yo itilize pou konsepsyon primè yo limite pa kote eleman jenetik, tankou mitasyon ki dirije sou sit, klonaj ekspresyon, oswa konstriksyon ak manipilasyon eleman jenetik yo itilize pou jeni ADN.
Yon metòd komen pou limite aktivite Taq DNA polymerase se prepare solisyon reyaksyon PCR sou glas epi mete l nan yon aparèy PCR prechofe.Metòd sa a se senp ak chè, men li pa konplete aktivite a nan anzim la ak Se poutèt sa pa konplètman elimine anplifikasyon nan pwodwi ki pa espesifik.
Priming tèmik reta sentèz ADN pa anpeche yon eleman esansyèl jiskaske aparèy PCR la rive nan tanperati denaturasyon.Pifò metòd manyèl inisyasyon tèmik, ki gen ladan adisyon reta nan Taq DNA polymerase, yo ankonbran, espesyalman pou aplikasyon pou gwo debi.Lòt metòd priming tèmik itilize yon plak pwotèj sir pou fèmen yon eleman esansyèl, ki gen ladan iyon mayezyòm oswa anzim, oswa pou izole fizikman eleman reyaktif, tankou modèl ak tanpon.Pandan sik tèmik la, konpozan yo divès kalite yo lage ak melanje ansanm kòm sir la fonn.Menm jan ak metòd manyèl kòmanse cho, metòd pwoteksyon sir ankonbran ak tandans kontaminasyon epi li pa apwopriye pou aplikasyon pou gwo debi.
Platinum DNA polymerase se pratik ak efikas pou PCR otomatik kòmanse cho.Platinum Taq DNA polymerase konsiste de recombinant Taq DNA polymerase konbine avèk antikò monoklonal kont Taq DNA polymerase.Antikò yo fòmile pa PCR pou anpeche aktivite anzim pandan kenbe tanperati pwolonje.Taq DNA polymerase te lage nan reyaksyon an pandan izolasyon 94 ℃ nan etap denaturasyon an, retabli aktivite polymerase konplè.Kontrèman ak Taq DNA polymerase chimikman modifye pou inisyasyon tèmik, anzim Platinum pa mande pou izolasyon pwolonje nan 94 ℃ (10 a 15 minit) pou aktive polymerase la.Avèk PlatinumTaq DNA polymerase, 90% aktivite Taq DNA polymerase te retabli apre 2 minit nan 94 ℃.
11. Nich-PCR
Jij siksesif nan anplifikasyon lè l sèvi avèk primè enbrike ka amelyore espesifik ak sansiblite.Premye tou a se yon anplifikasyon estanda 15 a 20 sik.Yon ti fraksyon nan premye pwodwi anplifikasyon an te dilye 100 a 1000 fwa epi li te ajoute nan dezyèm tou anplifikasyon pou 15 a 20 sik.Altènativman, premye pwodwi anplifye a ka gwosè pa pirifikasyon jèl.Yo itilize yon primè enbrike nan dezyèm tou anplifikasyon, ki ka mare nan sekans sib andedan premye primè a.Itilizasyon PCR enbrike diminye posiblite pou anplifikasyon plizyè sit sib paske gen kèk sekans sib konplemantè ak tou de seri primè yo.Menm kantite total sik (30 a 40) ak menm primè yo anplifye sit ki pa espesifik yo.Nich PCR ogmante sansiblite nan sekans sib limite (egzanp, mrnas ra) ak amelyore espesifik PCRS difisil (egzanp 5′ RACE).
12. Desandan PCR
Desandan PCR amelyore espesifik lè l sèvi avèk kondisyon rkwir sere pou premye sik PCR yo.Sik la kòmanse nan yon tanperati rkwir apeprè 5 ℃ pi wo pase Tm estime a, Lè sa a, chak sik redwi pa 1 ℃ a 2 ℃ jiskaske tanperati rkwit la pi ba pase Tm 5 ℃.Se sèlman modèl destinasyon an ak omoloji ki pi wo a pral anplifye.Pwodui sa yo kontinye elaji nan sik ki vin apre yo, sa ki anplifye pwodwi ki pa espesifik yo.Desandan PCR itil pou metòd kote yo pa konnen degre omoloji ant primè ak modèl sib, tankou anprent ADN AFLP.
Kits PCR ki gen rapò
2 × ewo PCR laTMSistèm Mix gen pi wo tolerans pou inhibiteurs PCR pase sistèm PCR Mix òdinè, epi li ka byen fasil fè fas ak anplifikasyon PCR nan divès modèl konplèks.Sistèm reyaksyon inik ak segondè-efikasite Taq Hero fè reyaksyon PCR la gen pi wo efikasite anplifikasyon, espesifik ak sansiblite.
Pi wo efikasite anplifikasyon
Li gen aktivite 5'→3' ADN polymerase ak 5'→3' aktivite eksonukleaz, san aktivite 3'→5' eksonukleaz.
Tan reyèl PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Twous
Espesifik-optimize tanpon ak cho-start Taq anzim ka anpeche anplifikasyon ki pa espesifik ak fòmasyon dimè primè.
Segondè sansiblite-ka detekte kopi modèl ki ba
RT-PCR Easyᵀᴹ I (yon sèl etap)
Twous la sèvi ak yon reyaktif transkripsyon ranvèse Foregene inik ak Foregene HotStar Taq DNA Polymerase konbine avèk yon sistèm reyaksyon inik pou efektivman amelyore efikasite anplifikasyon ak espesifik reyaksyon an.
Lè poste: Me-09-2023
