一、Ogmante sansiblite sistèm reyaksyon an:

1. Izole kalite siperyè RNA:

Siksè sentèz cDNA soti nan bon jan kalite RNA.RNA-wo kalite yo ta dwe omwen plen longè epi yo pa gen inibitè transkriptaz ranvèse tankou EDTA oswa SDS.Kalite RNA detèmine kantite maksimòm enfòmasyon sekans ou ka transkri nan cDNA.Yon metòd pirifikasyon RNA komen se yon metòd yon sèl etap lè l sèvi avèk guanidine isothiocyanate / asid fenol.Pou anpeche kontaminasyon pa tras kantite RNase, RNA izole nan echantiyon ki gen RNase (tankou pankreyas) bezwen estoke nan fòmaldeyid pou konsève RNA bon jan kalite, espesyalman pou depo alontèm.Te RNA ekstrè nan fwa rat fondamantalman degrade apre yo te estoke nan dlo pou yon semèn, pandan y ap RNA a ekstrè nan larat rat rete estab apre yo te estoke nan dlo pou 3 ane.Anplis de sa, transkripsyon ki pi long pase 4 kb yo pi sansib a degradasyon pa tras RNases pase transkripsyon ti.Pou ogmante estabilite echantiyon RNA ki estoke, RNA ka fonn nan formamid deyonize epi estoke nan -70 ° C.Fòmamid yo itilize pou konsève RNA yo dwe san debri ki degrade RNA.RNA ki soti nan pankreyas ka konsève nan formamid pou omwen yon ane.Lè w ap prepare pou itilize RNA, ou ka itilize metòd sa a pou presipite RNA: ajoute NaCl nan 0.2M ak 4 fwa volim etanòl, mete nan tanperati chanm pou 3-5 minit, epi santrifije nan 10,000 × g pou 5 minit.

2. Sèvi ak RNaseH-inaktif (RNaseH-) ranvèse transkriptaz la:

Inibitè RNase yo souvan ajoute nan reyaksyon transkripsyon ranvèse ogmante longè ak sede nan sentèz cDNA.Inibitè RNase yo ta dwe ajoute pandan reyaksyon sentèz premye strand nan prezans yon tanpon ak yon ajan rediksyon (tankou DTT), paske pwosesis la anvan sentèz cDNA denatire inibitè a, kidonk lage RNase mare ki ka degrade RNA.Pwoteyin RNase inhibiteurs sèlman anpeche degradasyon RNA pa RNase A, B, C, epi yo pa anpeche RNase sou po a, kidonk fè atansyon pa prezante RNase nan dwèt ou malgre itilize nan inhibiteurs sa yo.

Transkriptaz ranvèse katalize konvèsyon RNA an cDNA.Tou de M-MLV ak AMV gen aktivite andojèn RNaseH anplis aktivite pwòp polymerase yo.Aktivite RNaseH ak aktivite polymerase fè konpetisyon youn ak lòt pou seksyon ibrid ki fòme ant modèl RNA a ak primè ADN oswa strand ekstansyon cDNA, epi degrade strand RNA nan konplèks RNA:DNA.Modèl RNA degrade pa aktivite RNaseH pa ka sèvi ankò kòm yon substrate efikas pou sentèz cDNA, ki diminye pwodiksyon an ak longè sentèz cDNA.Se poutèt sa, li ta benefisye elimine oswa redwi anpil aktivite RNaseH nan transkriptaz ranvèse.。

SuperScript Ⅱ ranvèse transkriptaz, RNaseH- MMLV ranvèse transkriptaz ak thermoScript ranvèse transkriptaz, RNaseH- AMV, ka jwenn plis kantite ak plis tout longè cDNA pase MMLV ak AMV.Sansiblite RT-PCR pral afekte pa kantite sentèz cDNA.ThermoScript pi sansib pase AMV.Gwosè pwodwi RT-PCR limite pa kapasite transkriptaz ranvèse pou fè sentèz cDNA, espesyalman lè klonaj pi gwo cDNA.Konpare ak MMLV, SuperScripⅡ siyifikativman ogmante sede a nan pwodwi long RT-PCR.RNaseH-reverse transcriptase la tou te ogmante thermostabilité, se konsa reyaksyon an ka fèt nan tanperati ki pi wo pase nòmal 37-42 ° C.Anba kondisyon sentèz yo sijere, sèvi ak oligo (dT) Jadendanfan ak 10 μCi nan [α-P] dCTP.Yo te kalkile pwodiksyon total premye strand yo lè l sèvi avèk metòd presipitasyon TCA.Tout longè cDNA yo te analize lè l sèvi avèk bann gwosè-klase elimine epi konte sou yon jèl agarose alkalin.

3. Ogmante tanperati enkubasyon pou transkripsyon ranvèse:

Yon tanperati enkubasyon ki pi wo ede louvri estrikti segondè RNA a, ogmante pwodiksyon an nan reyaksyon an.Pou pifò modèl RNA, enkubasyon RNA ak primè yo nan 65 °C san tanpon oswa sèl, ki te swiv pa refwadisman rapid sou glas pral elimine pifò estrikti segondè yo epi pèmèt primè yo mare.Sepandan, kèk modèl toujou gen estrikti segondè, menm apre denaturasyon chalè.Anplifikasyon modèl difisil sa yo ka fèt lè l sèvi avèk ThermoScript Reverse Transcriptase epi mete reyaksyon ranvèse transkripsyon an nan yon tanperati ki pi wo pou amelyore anplifikasyon.Tanperati enkubasyon ki pi wo yo ka ogmante spesifik tou, sitou lè yo itilize premye jene espesifik (GSP) pou sentèz cDNA (gade chapit 3).Si w ap itilize GSP, asire w ke Tm nan primè yo se menm jan ak tanperati enkubasyon espere a.Pa sèvi ak oligo (dT) ak primè o aza pi wo a 60 ° C.Primè o aza mande pou enkubasyon nan 25 ° C pou 10 minit anvan yo ogmante a 60 ° C.Anplis de sa nan itilize yon tanperati ranvèse transkripsyon ki pi wo, espesifikasyon ka amelyore tou lè w transfere dirèkteman melanj RNA/primer soti nan tanperati denaturasyon 65 °C nan tanperati enkubasyon transcription ranvèse epi ajoute yon melanj reyaksyon 2× pre-chofe (sentèz cDNA cho-start).Apwòch sa a ede anpeche pè a baz entèmolekilè ki rive nan pi ba tanperati.Chanjman tanperati miltip ki nesesè pou RT-PCR ka senplifye lè l sèvi avèk yon sikilasyon tèmik.

Tth thermostable polymerase aji kòm yon ADN polymerase nan prezans Mg2 + ak kòm yon RNA polymerase nan prezans Mn2 +.Li ka kenbe cho nan yon tanperati maksimòm de 65 ° C.Sepandan, prezans Mn2 + pandan PCR diminye fidelite, sa ki fè Tth polymerase mwens apwopriye pou anplifikasyon segondè-presizyon, tankou klonaj cDNA.Anplis de sa, Tth gen efikasite transcription ranvèse ki ba, ki diminye sansiblite, epi, depi transcription ranvèse ak PCR ka fèt ak yon sèl anzim, reyaksyon kontwòl san transcription ranvèse pa ka itilize yo konpare pwodwi anplifikasyon cDNA ak kontamine ADN jenomik.Pwodwi anplifikasyon yo te separe.

4. Aditif ki ankouraje transkripsyon ranvèse:

Additif ki gen ladan gliserin ak DMSO yo ajoute nan reyaksyon sentèz premye strand la, sa ki ka diminye estabilite nan asid nikleyik doub-strand ak demare estrikti segondè RNA a.Jiska 20% gliserin oswa 10% DMSO ka ajoute san yo pa afekte aktivite SuperScript II oswa MMLV.AMV kapab tou tolere jiska 20% gliserin san pèt aktivite.Pou maksimize sansiblite RT-PCR nan reyaksyon transkripsyon ranvèse SuperScriptⅡ, yo ka ajoute 10% gliserin ak enkubasyon nan 45 ° C.Si yo ajoute 1/10 nan pwodwi reyaksyon ranvèse transkripsyon an nan PCR, Lè sa a, konsantrasyon nan gliserin nan reyaksyon anplifikasyon an se 0.4%, ki pa ase pou anpeche PCR.

5. RNaseH trete:

Tretman nan reyaksyon sentèz cDNA ak RNaseH anvan PCR ka ogmante sansiblite.Pou kèk modèl, li panse ke RNA nan reyaksyon an sentèz cDNA anpeche obligatwa nan pwodwi anplifikasyon, nan ka sa a tretman RNaseH ka ogmante sansiblite.Anjeneral, tretman RNaseH nesesè lè w ap anplifye modèl sib cDNA ki pi long, tankou scheroz tuber II.Pou modèl difisil sa a, tretman RNaseH amelyore siyal ki te pwodwi pa SuperScript II oswa AMV-sentèz cDNA.Pou pifò reyaksyon RT-PCR, tretman RNaseH opsyonèl, paske etap denaturasyon PCR a nan 95 °C jeneralman idrolize RNA a nan konplèks RNA:DNA.

6. Amelyorasyon Ti RNA Deteksyon Metòd:

RT-PCR se yon defi espesyalman lè sèlman ti kantite RNA ki disponib.Glikojèn ajoute kòm yon konpayi asirans pandan izolasyon RNA ede ogmante sede ti echantiyon yo.RNase-gratis glikojèn ka ajoute an menm tan ak ajoute Trizol.Glikojèn se dlo idrosolubl epi yo ka kenbe nan faz akeuz la ak RNA pou ede presipitasyon ki vin apre.Pou echantiyon mwens pase 50 mg tisi oswa 106 selil kiltive, konsantrasyon rekòmande nan glikojèn RNase-gratis se 250 μg / ml.

Ajoute BSA acetylated nan reyaksyon transkripsyon ranvèse lè l sèvi avèk SuperScript II ka ogmante sansiblite a, epi pou ti kantite RNA, diminye kantite SuperScript II epi ajoute 40 inite RNaseOut nuclease inhibitor ka ogmante nivo deteksyon an.Si yo itilize glikojèn nan pwosesis izolasyon RNA, li toujou rekòmande pou ajoute inibitè BSA oswa RNase lè w ap itilize SuperScript II pou reyaksyon transcription inverse.

二、Ogmante espesifik RT-PCR

1. CND Asintèz:

Premye-seksyon cDNA sentèz ka inisye lè l sèvi avèk twa metòd diferan, espesifik relatif la ki afekte kantite ak kalite cDNA sentèz.

Metòd primè o aza te pi piti espesifik nan twa metòd yo.Primers anneal nan plizyè sit atravè transkripsyon an, jenere kout, yon pati nan longè cDNA.Metòd sa a souvan itilize pou jwenn sekans fen 5′ epi pou jwenn cDNA nan modèl RNA ki gen rejyon nan estrikti segondè oswa ak sit revokasyon ki pa ka repwodui pa transkriptaz ranvèse.Pou jwenn cDNA ki pi long la, yo dwe detèmine rapò primè ak RNA nan chak echantiyon RNA anpirikman.Konsantrasyon kòmanse nan primè o aza te varye ant 50 a 250 ng pou chak 20 μl reyaksyon.Depi cDNA sentèz soti nan RNA total lè l sèvi avèk primè o aza se sitou RNA ribozomal, jeneralman yo chwazi poly(A) + RNA kòm modèl la.

Jadendanfan Oligo(dT) yo pi espesifik pase primè o aza.Li ibrid ak poly(A) ke yo jwenn nan fen 3′ nan pifò mRNA ekaryotik yo.Paske poly(A)+ RNA se apeprè 1% a 2% nan RNA total, kantite ak konpleksite cDNA se pi piti anpil pase ak primè o aza.Akòz gwo espesifikasyon li yo, oligo(dT) jeneralman pa mande pou optimize rapò RNA ak primè ak seleksyon poly(A)+.Li rekòmande pou itilize 0.5μg oligo (dT) pou chak 20μl sistèm reyaksyon.oligo (dT) 12-18 se apwopriye pou pifò RT-PCR.Sistèm ThermoScript RT-PCR la ofri oligo(dT)20 akòz pi bon estabilite tèmik li pou pi wo tanperati enkubasyon.

Gene Specific Primers (GSP) se premye primè ki pi espesifik pou etap transkripsyon ranvèse la.GSP se yon oligonukleotid antisans ki ka spesyalman ibrid ak sekans sib RNA a, kontrèman ak primè o aza oswa oligo(dT), ki anneal ak tout RNA yo.Menm règ yo itilize pou konsepsyon primè PCR aplike nan konsepsyon GSP nan reyaksyon transkripsyon ranvèse.GSP a ka se menm sekans kòm primè anplifikasyon an ki rkwit nan fen 3′-pi mRNA a, oswa GSP a ka fèt pou rkwit en nan Jadendanfan anplifikasyon ranvèse a.Pou kèk matyè anplifye, plis pase yon primè antisans bezwen fèt pou RT-PCR siksè paske estrikti segondè nan RNA sib la ka anpeche primè obligatwa.Li rekòmande pou itilize 1 pmol antisense GSP nan yon reyaksyon sentèz premye strand 20 μl.

2. Ogmante tanperati enkubasyon pou transkripsyon ranvèse:

Yo nan lòd yo pran anpil avantaj de avantaj ki genyen nan espesifik GSP, yo ta dwe itilize yon transkriptaz ranvèse ki gen pi wo tèmostabilite.Transkriptaz ranvèse tèmik ka enkube nan pi wo tanperati pou ogmante sevè reyaksyon.Pou egzanp, si yon GSP anneal nan 55 ° C, espesifik nan GSP a pa pral konplètman itilize si AMV oswa M-MLV yo itilize pou transkripsyon ranvèse nan yon sevè ki ba nan 37 ° C.Sepandan, SuperScript II ak ThermoScript ka reyaji nan 50 ° C oswa pi wo, ki pral elimine pwodwi ki pa espesifik ki te pwodwi nan pi ba tanperati.Pou espesifikasyon maksimòm, yo ka transfere melanj RNA/primer ki soti dirèkteman nan tanperati denaturasyon 65 °C nan tanperati enkubasyon transcription ranvèse a epi ajoute nan yon melanj reyaksyon 2× pre-chofe (sentèz cDNA kòmanse cho).Sa a ede anpeche appariement baz entèmolekilè nan tanperati ki ba.Tranzisyon tanperati miltip ki nesesè pou RT-PCR ka senplifye lè l sèvi avèk yon sikilasyon tèmik.

3. Diminye kontaminasyon ADN jenomik:

Yon difikilte potansyèl rankontre ak RT-PCR se kontaminasyon ADN jenomik nan RNA a.Sèvi ak yon bon metòd izolasyon RNA, tankou Trizol Reagent, ap diminye kantite ADN jenomik ki kontamine preparasyon RNA a.Pou evite pwodwi ki sòti nan ADN jenomik, RNA ka trete ak DNase I nan klas anplifikasyon pou retire ADN ki kontamine anvan transkripsyon ranvèse.Yo te sispann dijesyon DNase I nan enkubasyon echantiyon yo nan 2.0 mM EDTA pou 10 minit nan 65 ° C.EDTA ka chelate iyon mayezyòm, anpeche idroliz RNA depandan ion mayezyòm nan tanperati ki wo.

Yo nan lòd yo separe cDNA anplifye soti nan kontamine pwodwi anplifikasyon ADN jenomik, primè yo ka fèt ke chak rkwire separe exons.Pwodwi PCR ki sòti nan cDNA yo pral pi kout pase sa ki sòti nan ADN jenomik ki kontamine.Anplis de sa, yo te fè yon eksperyans kontwòl san transkripsyon ranvèse sou chak modèl RNA pou detèmine si yon fragman yo te sòti nan ADN jenomik oswa cDNA.Pwodwi PCR yo jwenn san transkripsyon ranvèse sòti nan genòm nan.