1. Konesans debaz (si ou vle wè pati eksperimantal la, tanpri transfere dirèkteman nan dezyèm pati a)
Kòm yon reyaksyon derive nan PCR konvansyonèl, PCR an tan reyèl sitou kontwole chanjman an nan kantite pwodwi anplifikasyon nan chak sik nan reyaksyon an anplifikasyon PCR an tan reyèl atravè chanjman nan siyal la fluoresans, ak quantitatively analize modèl la kòmanse atravè relasyon ki genyen ant valè a ct ak koub estanda a.
Done espesifik RT-PCR yodebaz, papòt fliyoresansepiCt valè.
| debaz: | Valè fliyoresans 3yèm-15yèm sik la se debaz (debaz), ki koze pa erè okazyonèl mezi a. |
| Papòt (papòt): | Refere a limit deteksyon fliyoresan yo mete nan yon pozisyon apwopriye nan rejyon kwasans eksponansyèl koub anplifikasyon an, jeneralman 10 fwa devyasyon estanda debaz la. |
| Valè CT: | Li se kantite sik PCR lè valè fluoresans nan chak tib reyaksyon rive nan papòt la. Valè Ct a se envès pwopòsyonèl ak kantite modèl inisyal la. |
Metòd etikèt komen pou RT-PCR:
| metòd | avantaj | enpèfeksyon | dimansyon aplikasyon an |
| SYBR GreenⅠ | Aplikasyon lajè, sansib, bon mache ak pratik | Kondisyon pou Jadendanfan yo wo, yo gen tandans fè bann ki pa espesifik | Li apwopriye pou analiz quantitative nan divès kalite jèn sib, rechèch sou ekspresyon jèn, ak rechèch sou bèt ak plant recombinant transjenik. |
| TaqMan | Bon espesifikasyon ak repetibilite segondè | Pri a wo epi sèlman apwopriye pou objektif espesifik. | Deteksyon patojèn, rechèch sou jèn rezistans dwòg, evalyasyon efikasite dwòg, dyagnostik maladi jenetik. |
| molekilè limyè | Segondè espesifik, fliyoresans, background ki ba | Pri a wo, li se sèlman apwopriye pou yon objektif espesifik, konsepsyon an se difisil, ak pri a se wo. | Analiz espesifik jèn, analiz SNP |
2. etap eksperimantal
2.1 Konsènan gwoupman eksperimantal la- dwe genyen plizyè pwi nan gwoup la, epi fòk gen repetisyon byolojik.
| ① | Kontwòl vid | Itilize pou detekte sitiyasyon kwasans selil nan eksperyans |
| ② | SiRNA kontwòl negatif (sekans siRNA ki pa espesifik) | Demontre espesifik aksyon RNAi.siRNA ka pwovoke repons estrès ki pa espesifik nan yon konsantrasyon 200nM. |
| ③ | Kontwòl reyaktif transfèksyon | Ekskli toksisite reyaktif transfeksyon an nan selil yo oswa efè sou ekspresyon jèn sib la. |
| ④ | siRNA kont jèn sib | Frape ekspresyon jèn sib la |
| ⑤ (opsyonèl) | siRNA pozitif | Itilize pou rezoud pwoblèm sistèm eksperimantal ak pwoblèm operasyonèl |
| ⑥ (opsyonèl) | Fluoresan kontwòl siRNA | Ou ka obsève efikasite transfè selilè ak yon mikwoskòp |
2.2 Prensip konsepsyon Jadendanfan
| Gwosè fragman anplifye | De preferans nan 100-150bp |
| Primer Longè | 18-25bp |
| Kontni GC | 30% -70%, de preferans 45% -55% |
| Tm valè | 58-60 ℃ |
| Sekans | Evite T/C kontinyèl;A/G kontinyèl |
| 3 fen sekans | Evite GC rich oswa AT rich;baz tèminal la se de preferans G oswa C;li pi bon pou evite T |
| Konplemantarite | Evite sekans konplemantè ki gen plis pase 3 baz nan Jadendanfan an oswa ant de Jadendanfan |
| Espesifik | Sèvi ak rechèch eksplozyon pou konfime spesifik Jadendanfan |
①SiRNA se espès espesifik, ak sekans diferan espès yo pral diferan.
②SiRNA pake nan poud friz-seche, ki ka estoke ki estab pou 2-4 semèn nan tanperati chanm.
2.3 Zouti oswa reyaktif ki bezwen prepare davans
| Prensipal (referans entèn) | Ki gen ladan pi devan ak ranvèse de |
| Primers (jèn sib) | Ki gen ladan pi devan ak ranvèse de |
| Target Si RNA (3 bann) | Anjeneral, konpayi an pral fè sentèz 3 bann, ak Lè sa a, chwazi youn nan twa yo pa RT-PCR |
| Twous transfèksyon | Lipo2000 elatriye. |
| RNA Rapid Ekstraksyon Twous | Pou fè ekstraksyon RNA apre transfèksyon |
| Rapid Ranvèse Transcription Twous | pou sentèz cDNA |
| Twous anplifikasyon PCR | 2×Super SYBR Green qPCR Mèt Mix |
2.4 Konsènan pwoblèm yo ki bezwen peye atansyon sou nan etap espesifik eksperimantal yo:
①siRNA transfection pwosesis
1. Pou plating, ou ka chwazi plak 24-byen, plak 12-byen oswa plak 6-byen (konsantrasyon an mwayèn RNA pwopoze nan chak pi nan yon plak 24-byen se apeprè 100-300 ng / uL), ak dansite transfè optimal nan selil se jiska 60% -80% oswa konsa.
2. Etap transfeksyon yo ak kondisyon espesifik yo se entèdi ak enstriksyon yo.
3. Apre transfeksyon, echantiyon yo ka kolekte nan 24-72 èdtan pou deteksyon mRNA (RT-PCR) oswa deteksyon pwoteyin nan 48-96 èdtan (WB)
② Pwosesis ekstraksyon RNA
1. Anpeche kontaminasyon pa anzim ekzojèn.Li sitou gen ladan mete mask ak gan entèdi;lè l sèvi avèk konsèy pipèt esterilize ak tib EP;dlo ki itilize nan eksperyans la dwe RNase-Free.
2. Li rekòmande fè de fwa jan yo sijere nan twous la ekstraksyon rapid, ki pral reyèlman amelyore pite a ak sede.
3. Likid dechè a pa dwe manyen kolòn RNA a.
③ RNA quantification
Apre yo fin ekstrè RNA a, li ka quantifye dirèkteman ak Nanodrop, ak lekti minimòm lan ka osi ba ke 10ng/ul.
④ Pwosesis transkripsyon ranvèse
1. Akòz sansiblite segondè nan RT-qPCR, yo ta dwe fè omwen 3 pwi paralèl pou chak echantiyon pou anpeche Ct ki vin apre a twò diferan oswa SD la twò gwo pou analiz estatistik.
2. Pa jele ak dekonjle Master mix repete.
3. Chak tib/twou dwe ranplase ak yon nouvo pwent!Pa kontinyèlman itilize menm pwent pipèt la pou ajoute echantiyon!
4. Fim nan tache ak plak la 96-byen apre li fin ajoute echantiyon an bezwen lis ak yon plak.Li pi bon santrifuje anvan ou mete l sou machin nan, pou likid la sou miray tib la ka koule desann epi retire bul lè.
⑤Komen analiz koub
| Pa gen peryòd kwasans logaritmik | Li posib konsantrasyon segondè nan modèl |
| Pa gen valè CT | Etap ki pa kòrèk pou detekte siyal fliyoresan; degradasyon primè oswa sond - entegrite li yo ka detekte pa elektwoforèz PAGE; ensifizan kantite modèl; degradasyon nan modèl - evite entwodiksyon nan enpurte ak repete konjelasyon ak dekonjle nan preparasyon echantiyon; |
| Ct>38 | Ba efikasite anplifikasyon;Pwodwi PCR twò lontan;divès konpozan reyaksyon yo degrade |
| Koub anplifikasyon lineyè | Sond yo ka pasyèlman degrade pa sik repete friz-dekonjle oswa ekspoze pwolonje a limyè |
| Diferans nan twou kopi se patikilyèman gwo | Solisyon reyaksyon an pa fonn nèt oswa solisyon reyaksyon an pa melanje;beny tèmik enstriman PCR la kontamine ak sibstans fliyoresan |
2.5 Konsènan analiz done
Analiz done qPCR ka divize an quantification relatif ak quantification absoli.Pou egzanp, selil nan gwoup tretman an konpare ak selil nan gwoup kontwòl la,
Konbyen fwa mRNA nan jèn X chanje, sa a se relatif quantification;nan yon sèten kantite selil, mRNA nan jèn X la
Konbyen kopi ki genyen, sa se quantification absoli.Anjeneral sa nou itilize pi plis nan laboratwa a se metòd relatif quantitative.Anjeneral,metòd 2-ΔΔctse itilize pi plis nan eksperyans, kidonk sèlman metòd sa a pral prezante an detay isit la.
Metòd 2-ΔΔct: Rezilta a jwenn se diferans ki genyen nan ekspresyon jèn sib la nan gwoup eksperimantal la konsènan jèn sib la nan gwoup kontwòl la.Li nesesè ke efikasite anplifikasyon tou de jèn sib la ak jèn referans entèn la tou pre 100%, ak devyasyon relatif la pa ta dwe depase 5%.
Metòd kalkil la se jan sa a:
Δct gwoup kontwòl = valè ct nan jèn sib nan gwoup kontwòl - valè ct nan jèn referans entèn nan gwoup kontwòl
Δct gwoup eksperimantal = ct valè jèn sib la nan gwoup eksperimantal la - valè ct jèn referans entèn nan gwoup eksperimantal la
ΔΔct=Δct gwoup eksperimantal-Δct gwoup kontwòl
Finalman, kalkile miltip diferans nan nivo ekspresyon:
Chanje pliye = 2-ΔΔct (ki koresponn ak fonksyon an Excel se POUVWA)
Pwodwi ki gen rapò:
Tan poste: Me-20-2023
