Nan premye etap epidemi an, akòz devlopman rapid, dyagnostik rapid pasyan yo sispèk se kle nan anpeche COVID-19.Gen kèk reyaktif deteksyon asid nikleyik apwouve ki gen yon tan devlopman kout, e gen pwoblèm tankou konfimasyon pèfòmans prese, optimize reyaktif ensifizan, ak gwo diferans ki genyen ant pakèt;Pwoblèm yo nan divès laboratwa klinik nan divès aspè nan pwosesis la deteksyon asid nikleyik ka afekte tou presizyon nan rezilta deteksyon asid nikleyik.Atik sa a pral konsantre sou lyen kle yo ak pwen nan deteksyon aktyèl asid nikleyik SARS-CoV-2, epi analize pwoblèm yo nan fo negatif ak pozitif re-egzamen nan deteksyon asid nikleyik laboratwa ak enkonsistans klinik.

Prensip deteksyon asid nikleyik SARS-CoV-2

SARS-CoV-2 se yon viris RNA ki gen yon sekans jenom apeprè 29 kb, ak 10 jèn, ki ka efektivman kode 10 pwoteyin.Viris yo konpoze de RNA ak pwoteyin, ak kouch ki pi eksteryè a se yon kouch ekstèn ki konpoze de lipid ak glikoprotein.Anndan, pwoteyin kapsid la vlope RNA a nan li, kidonk pwoteje RNA a fasil degradab (P1).

P1 Estrikti SARS-COV-2

Viris anvayi selil yo atravè reseptè sifas espesifik selil yo pou lakòz enfeksyon, epi sèvi ak selil lame yo pou repwodui.

Prensip deteksyon asid nikleyè viral la se ekspoze RNA viral atravè yon lisat selil, epi sèvi ak an tan reyèl fluorescent ranvèse transcription-polymerase chèn reyaksyon (RT-PCR) pou deteksyon.

Kle nan prensip deteksyon an se sèvi ak primè ak sond pou reyalize "matche vize" nan sekans asid nikleyik, se sa ki, jwenn sekans asid nikleyik nan SARS-CoV-2 ki diferan de lòt viris nan apeprè 30,000 baz (resanblans nan asid nikleyik ak lòt viris) "Ba" zòn), konsepsyon primè ak sond.

Jadendanfan yo ak sond yo trè matche ak rejyon espesifik SARS-CoV-2 asid nikleyik, se sa ki, espesifik la trè fò.Yon fwa rezilta anplifikasyon RT-PCR fliyoresan an tan reyèl echantiyon yo dwe teste a pozitif, li pwouve ke SARS-CoV-2 prezan nan echantiyon an.Gade P2.

P2 Etap detèminasyon asid nikleyik SARS-CoV-2 (RT-PCR fliyoresan an tan reyèl)

Kondisyon ak kondisyon laboratwa pou deteksyon asid nikleyik SARS-CoV-2

Laboratwa tès asid nikleik yo se pi ideyal pou anviwònman presyon negatif, epi yo ta dwe peye atansyon sou siveyans presyon, kenbe lè ap koule tankou dlo, epi elimine ayewosòl.Pèsonèl tès asid nikleik dwe gen kalifikasyon korespondan, resevwa fòmasyon reyaksyon chèn polymerase ki enpòtan epi pase evalyasyon an.Laboratwa a ta dwe estrikteman jere, zòn nan plas, ak pèsonèl ki pa enpòtan yo entèdi entèdi antre.Zòn pwòp la ta dwe vantile ak dezenfekte an plas.Atik ki enpòtan yo mete yo nan zòn, pwòp ak sal yo separe, ranplase alè, epi dekontamine an plas.Dezenfeksyon woutin: dezenfektan ki gen klò se solisyon prensipal la pou pi gwo zòn, epi yo ka itilize 75% alkòl pou ti zòn.Yon bon fason pou fè fas ak ayewosòl se louvri fenèt pou vantilasyon, epi dezenfeksyon lè a kapab tou fèt pa mwayen reyon iltravyolèt, filtraj ak dezenfeksyon lè.

Lyen kle ak paramèt detèminasyon asid nikleyik SARS-CoV-2 (an tan reyèl fluoresan RT-PCR)

Malgre ke laboratwa jeneralman peye anpil atansyon sou "deteksyon" asid nikleik, an reyalite, "ekstraksyon" asid nikleik se tou youn nan etap kle yo pou deteksyon siksè, ki se pre relasyon ak koleksyon an ak depo echantiyon viris yo.

Kounye a, echantiyon respiratwa ki pi lajman itilize, tankou prelèvman nasopharyngeal, sèvi ak dezyèm metòd la, ki se yon solisyon inaktivasyon (konsèvasyon) ki prepare ki baze sou ekstraksyon asid nikleyik ak solisyon liz.Sou yon bò, solisyon prezèvasyon viris sa a ka denatire pwoteyin viris la, pèdi aktivite li epi li pa gen enfeksyon ankò, epi amelyore sekirite transpò ak etap deteksyon an;an lòt men an, li ka dirèkteman krak viris la lage asid nikleyik la, elimine anzim dekonpozisyon asid nikleyik la, epi anpeche viris la.RNA a degrade.

Yon solisyon echantiyon viris prepare sou baz solisyon liz ekstraksyon asid nikleyik.Konpozan prensipal yo se sèl balanse, ajan ethylenediaminetetraacetic asid chelating, sèl guanidine (guanidine isothiocyanate, guanidine idroklorur, elatriye), surfactant anionik (dodecane) silfat sodyòm), surfactant kationik (tetradecyl trimethyl amonyòm oksalat), fenol, plizyè konpozan, 8-hydrothixythol, dihydroxythol.Kounye a, gen anpil kalite twous ekstraksyon asid nikleyik, epi yo itilize diferan reyaktif ekstraksyon asid nikleik ak pirifikasyon.Menm si yo itilize menm ekstraksyon asid nikleyik ak reyaktif pou pirifye, pwosedi ekstraksyon chak twous yo diferan.

Kounye a, pwodwi twous deteksyon asid nikleik apwouve pa National Medical Products Administration yo chwazi baze sou jèn ORF1ab, E ak N nan genòm SARS-CoV-2.Prensip deteksyon diferan pwodwi yo fondamantalman menm, men premye yo ak desen ankèt yo diferan.Gen segman yon sèl sib (ORF1ab), segman doub sib (ORF1ab, N oswa E), ak twa segman sib (ORF1ab, N ak E).Diferans ki genyen ant deteksyon ak entèpretasyon, ekstraksyon asid nikleyik ak sistèm reyaksyon RT-PCR fliyoresan an tan reyèl yo ta dwe refere a enstriksyon ki enpòtan pou twous yo, epi li rekòmande pou itilizatè yo entèdi swiv metòd entèpretasyon ki espesifye nan enstriksyon twous yo pou entèpretasyon.Rejyon komen yo, primè ak sekans pwofonde anplifye pa RT-PCR fliyoresan an tan reyèl yo montre nan P3.

P3 Kote sib anplikon SARS-CoV-2 sou genòm lan ak sekans primè ak sond

Entèpretasyon rezilta detèminasyon asid nikleyik SARS-CoV-2 (Rmanje-Time fluoresan RT-PCR)

"Plan Prevansyon ak Kontwòl Nemoni pou Enfeksyon SARS-CoV-2 (Dezyèm Edisyon)" pou premye fwa klarifye kritè yo pou jije rezilta anplifikasyon yon sèl jèn:

1. Pa gen Ct oswa Ct≥40 ki negatif;

2. Ct<37 pozitif;

3. Valè Ct 37-40 se zòn gri-echèl la.Li rekòmande pou repete eksperyans lan.Si rezilta refè Ct <40 ak koub anplifikasyon an gen pik evidan, yo jije echantiyon an kòm pozitif, otreman li negatif."

Twazyèm edisyon gid la ak katriyèm edisyon gid la kontinye kritè ki anwo yo.Sepandan, akòz diferan sib yo itilize nan twous komèsyal yo, 3yèm edisyon gid la mansyone pi wo a pa t bay kritè pou detèmine konbinezon sib yo, mete aksan sou Enstriksyon yo bay manifakti a va genyen.Apati senkyèm edisyon direktiv yo, de objektif yo te klarifye, espesyalman kritè jijman pou yon sèl sib ki difisil pou jije.Sa vle di, si laboratwa a vle konfime ke yon ka pozitif pou deteksyon asid nikleyik SARS-CoV-2, sa ki annapre yo dwe ranpli 1 nan 2 kondisyon:

(1) De sib SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) nan menm echantiyon an teste pozitif pa RT-PCR fliyoresan an tan reyèl.Si yon sèl sib pozitif, re-echantiyon ak re-tès obligatwa.Si rezilta tès yo Si sèl sib la toujou pozitif, yo jije li kòm pozitif.

(2) De echantiyon RT-PCR fliyoresan an tan reyèl te montre yon sèl sib pozitif an menm tan an oswa de echantiyon nan menm kalite a te montre yon sèl rezilta tès pozitif sib, ki ka jije kòm pozitif.Sepandan, direktiv yo tou mete aksan sou rezilta negatif tès asid nikleyik pa ka eskli enfeksyon SARS-CoV-2.Faktè ki ka lakòz fo negatif yo dwe eskli, tankou bon jan kalite echantiyon pòv (echantiyon respiratwa ki soti nan oropharynx ak lòt pati), koleksyon echantiyon twò bonè oswa twò ta, Echantiyon yo pa te estoke, transpòte, ak trete kòrèkteman, ak teknoloji nan tèt li te gen pwoblèm (varyasyon viris, anpèchman PCR), elatriye.

Kòz fo negatif nan deteksyon SARS-CoV-2

Konsèp "fo negatif" nan tès asid nikleyik ki konsène kounye a, souvan refere a "fo negatif" kote rezilta tès asid nikleyik yo enkonsistan ak manifestasyon klinik yo, se sa ki, sentòm klinik ak rezilta imaj yo trè sispèk nan COVID-19, men tès asid nikleyik yo toujou "negatif" anpil fwa.Sant Laboratwa Klinik Komisyon Nasyonal Sante a eksplike tès SARS-CoV-2 "fo negatif".

(1) Gen yon sèten kantite viris nan selil moun ki enfekte a.Done ki egziste deja yo montre ke apre kò a enfekte pa viris la, viris la antre nan gòj la nan nen ak bouch, Lè sa a, nan trachea a ak bronchi, ak Lè sa a, rive nan alveoli yo.Moun ki enfekte a pral fè eksperyans peryòd enkubasyon an, sentòm modere, ak Lè sa a, pwosesis la nan sentòm grav, ak diferan etap nan maladi a.Ak kantite viris ki prezan nan diferan pati nan kò a diferan.

An tèm de chaj viral nan kalite selil yo, selil epitelyal alveyòl (pi ba aparèy respiratwa)> selil epitelyal Airway (anwo aparèy respiratwa)> fibroblast, selil andotelyal, ak makrofaj, elatriye;soti nan kalite echantiyon an, likid lavaj alveolatè (ki pi Ekselan)> krache touse gwo twou san fon an> prelèvman nasopharyngeal> prelèvman oropharyngeal> san.Anplis de sa, viris la ka detekte tou nan poupou.Sepandan, konsidere konvenyans nan operasyon ak akseptasyon pasyan yo, lòd echantiyon klinik yo souvan itilize se oropharyngeal prelèvman> nasopharyngeal prelèvman> likid lavaj bwonch (operasyon konplèks) ak gwo krache (anjeneral tous sèk, difisil pou jwenn).

Se poutèt sa, kantite viris nan selil oropharynx oswa nasopharynx kèk pasyan yo piti oswa trè ba.Si sèlman echantiyon oropharynx oswa nasopharynx yo pran pou tès, asid nikleyik viral la p ap detekte.

(2) Pa gen okenn selil ki gen viris yo te kolekte pandan koleksyon echantiyon, oswa asid nikleyik viral pa te efektivman konsève.

[① Move sit koleksyon, pou egzanp, lè yo kolekte prelèvman oropharyngeal, pwofondè koleksyon an pa ase, prelèvman nasopharyngeal yo pa kolekte byen fon nan kavite nen an, elatriye. Pifò nan selil yo kolekte ka selil ki pa gen viris;

②Echantiyon prelèvman yo itilize mal.Pou egzanp, fib sentetik tankou fib PE, fib polyester ak fib polypropylène yo rekòmande pou materyèl la nan tèt la prelèvman.Fib natirèl tankou koton yo itilize nan operasyon aktyèl (adsorption fò nan pwoteyin epi li pa fasil yo lave soti) Ak fib nilon (pòv absòpsyon dlo, ki mennen nan volim echantiyon ensifizan);

③Move itilizasyon tib depo viris, tankou move itilizasyon polypropylène oswa tib depo plastik polyethylene ki fasil pou absòbe asid nikleyik (DNA/RNA), sa ki lakòz yon diminisyon nan konsantrasyon asid nikleyik nan solisyon depo a.Nan pratik, li rekòmande pou itilize polyethylene-propylène polymère plastik ak kèk resipyan plastik polypropylène trete espesyalman pou estoke asid nikleyik viral.]

[① Move sit koleksyon, pou egzanp, lè yo kolekte prelèvman oropharyngeal, pwofondè koleksyon an pa ase, prelèvman nasopharyngeal yo pa kolekte byen fon nan kavite nen an, elatriye. Pifò nan selil yo kolekte ka selil ki pa gen viris;

②Echantiyon prelèvman yo itilize mal.Pou egzanp, fib sentetik tankou fib PE, fib polyester ak fib polypropylène yo rekòmande pou materyèl la nan tèt la prelèvman.Fib natirèl tankou koton yo itilize nan operasyon aktyèl (adsorption fò nan pwoteyin epi li pa fasil yo lave soti) Ak fib nilon (pòv absòpsyon dlo, ki mennen nan volim echantiyon ensifizan);

③Move itilizasyon tib depo viris, tankou move itilizasyon polypropylène oswa tib depo plastik polyethylene ki fasil pou absòbe asid nikleyik (DNA/RNA), sa ki lakòz yon diminisyon nan konsantrasyon asid nikleyik nan solisyon depo a.Nan pratik, li rekòmande pou itilize polyethylene-propylène polymère plastik ak kèk resipyan plastik polypropylène trete espesyalman pou estoke asid nikleyik viral.]

(4) Operasyon laboratwa klinik la pa estanda.Egzanp transpò ak kondisyon depo, operasyon ofisyèl nan laboratwa klinik, entèpretasyon rezilta ak kontwòl kalite se faktè kle yo asire presizyon ak fyab nan rezilta tès yo.Dapre rezilta evalyasyon ekstèn kalite ki fèt pa Sant Laboratwa Klinik Komisyon Nasyonal Sante 16-24 mas 2020, nan 844 laboratwa ki te resevwa rezilta valab, 701 (83.1%) te kalifye, epi 143 (16.9%) pa t '.Kalifye, kondisyon tès laboratwa jeneral yo bon, men diferan laboratwa toujou gen diferans nan kapasite operasyon pèsonèl, kapasite entèpretasyon echantiyon pozitif yon sèl-sib, ak kontwòl kalite.

Ki jan yo diminye fo negatif deteksyon asid nikleyik SARS-CoV-2?

Diminye fo negatif nan deteksyon asid nikleyik yo ta dwe optimize nan kat aspè yo nan pwodwi fo negatif.

(1) Gen yon sèten kantite viris nan selil moun ki enfekte a.Konsantrasyon viris la nan diferan pati nan kò moun ki sispèk enfekte yo pral diferan nan diferan moman.Si pa gen farinks, li ka nan likid lavaj bwonch oswa poupou.Si plizyè kalite echantiyon yo ka kolekte an menm tan oswa nan diferan etap nan pwogresyon maladi pou tès la, pral ede evite fo negatif.

(2) Yo ta dwe kolekte selil ki gen viris pandan koleksyon echantiyon yo.Pwoblèm sa a ka rezoud nan yon gwo limit pa ranfòse fòmasyon an nan pèseptè echantiyon.

(3) Reyaktif IVD serye.Lè w fè rechèch sou evalyasyon pèfòmans deteksyon reyaktif yo nan nivo nasyonal la, epi diskite sou pwoblèm ki egziste deja yo, efikasite deteksyon reyaktif yo ka amelyore plis epi sansiblite analiz yo ka amelyore.

(4) Operasyon ofisyèl nan laboratwa klinik yo.Lè yo ranfòse fòmasyon pèsonèl laboratwa yo, kontinye amelyore sistèm jesyon kalite laboratwa a, asire divizyon rezonab, ak amelyore kapasite pèsonèl yo pou detekte, li posib pou redwi fo negatif akòz move operasyon laboratwa.

Rezon pou re-tès pozitif SARS-CoV-2 tès asid nikleyik nan pasyan refè ak egzeyat

"Plan dyagnostik ak tretman COVID-19 (esè setyèm edisyon)" klèman endike ke youn nan kritè pou pasyan COVID-19 yo geri ak egzeyate nan lopital la se ke de echantiyon aparèy respiratwa youn apre lòt gen yon tès asid nikleyik negatif (omwen 24 èdtan apa), men gen anpil kèk pasyan SARS-CoV-2 te pozitif ankò akòz divès rezon ki fè tès asid nikleyik yo te pozitif nan tès asid nikleyik.

(1)SARS-CoV-2 se yon nouvo viris.Li nesesè plis konprann mekanis patojèn li yo, foto an plen nan maladi a ki te koze ak karakteristik sa yo nan kou maladi a.Se poutèt sa, sou yon bò, li nesesè ranfòse jesyon an nan pasyan egzeyate ak fè obsèvasyon medikal 14 jou.Fè swivi, siveyans sante ak konsèy sante apwofondi konpreyansyon yo genyen sou tout pwosesis la nan ensidan an, devlopman ak rezilta nan maladi a.

(2) Pasyan an ka enfekte ak viris la ankò.Akademisyen Zhong Nanshan te di: Paske pasyan geri yo gen antikò, SARS-CoV-2 ka elimine pa antikò lè yo anvayi ankò.Gen anpil rezon, ki ka kòz la nan pasyan an refè, oswa li ka gen rapò ak mitasyon an nan viris la, oswa menm kòz la nan tès laboratwa.Si se viris la li menm, mitasyon SARS-CoV-2 ka lakòz antikò ki pwodui pa pasyan refè a pa efikas kont viris mitasyon an.Si pasyan an enfekte ak viris mitasyon an ankò, tès asid nikleyik la ka pozitif ankò.

(3) Osi lwen ke metòd tès laboratwa yo konsène, chak metòd tès gen limit li yo.Deteksyon asid nikleyè SARS-CoV-2 se akòz chwa nan sekans jèn, konpozisyon reyaktif, sansiblite metòd la ak lòt rezon, ki mennen nan twous yo ki deja egziste gen pwòp limit deteksyon pi ba yo.Apre yo fin trete pasyan an, viris la nan kò a diminye.Lè chaj viral nan echantiyon an yo dwe teste a pi ba pase limit ki pi ba nan deteksyon, yon rezilta "negatif" ap parèt.Sepandan, rezilta sa a pa vle di ke viris la nan kò a te konplètman disparèt.Viris la ka apre tretman an sispann.Resurgence”, kontinye kopye.Se poutèt sa, li rekòmande pou revize yon fwa pa semèn nan 2 a 4 semèn apre egzeyat.

(4) Asid nikleik se materyèl jenetik viris la.Viris la touye apre pasyan an te sibi tretman antiviral, men rès fragman RNA viral yo toujou kenbe nan kò imen an, epi yo pa konplètman egzeyate nan kò a.Pafwa, nan sèten sikonstans, li ka plis kenbe.Yon bon bout tan, ak nan moman sa a tès la asid nikleyik yo pral "tranzitwa" pozitif.Avèk ekstansyon tan rekiperasyon pasyan an, apre fragman rezidyèl RNA nan kò a piti piti fin itilize, rezilta tès asid nikleyik la ka vire negatif.

(5) Rezilta tès asid nikleyik SARS-CoV-2 sèlman pwouve prezans oswa absans RNA viral, epi li pa kapab pwouve aktivite viris la epi si viris la transmèt.Li nesesè pou pwouve si yon pasyan ki gen yon tès asid nikleyik pozitif ankò ap tounen yon sous enfeksyon ankò.Li nesesè fè kilti viris sou echantiyon klinik ak kiltive yon viris "viv" pou pwouve ke li se enfektye.

Rezime

An rezime, asid nikleyik SARS-CoV-2 teste fo negatif, retest pozitif, ak lòt kondisyon ki pa konsistan avèk manifestasyon klinik yo pa ka konplètman evite.Nan tès depistaj aktyèl ak tès, li rekòmande pou konbine sentòm klinik, egzamen D (CT) ak eksperyans tès laboratwa (tès asid nikleyik + tès antikò espesifik viris) rezilta pou dyagnostik konplè pou anpeche dyagnostik rate ak dyagnostik move.Si rezilta tès yo jwenn evidamman enkonsistan ak manifestasyon klinik yo, li rekòmande pou fè yon analiz konplè sou tout lyen tès la (koleksyon echantiyon, sikilasyon ak lyen pwosesis) pou eskli viris SARS-CoV-2 enfeksyon bonè, enfeksyon renouvlab oswa konbine avèk lòt enfeksyon viris respiratwa, elatriye.Si kondisyon yo pèmèt, li rekòmande pou kolekte echantiyon ki pi sansib tankou krache oswa likid lavaj alveolatè pou re-egzamen.

Pwodwi ki gen rapò:

SARS-CoV-2 Twous Deteksyon Asid Nukleik (Multiplex PCR Fluorescent Sond Metòd)