Nan eksperyans qPCR, konsepsyon Jadendanfan tou se yon lyen trè enpòtan.Kit primè yo apwopriye oswa ou pa gen rapò ak si wi ou non efikasite anplifikasyon an rive nan estanda a, si pwodwi yo anplifye yo espesifik, ak si rezilta eksperimantal yo disponib.
Se konsa, ki jan yo fè espesifikite Jadendanfan qPCR pi byen?Segondè efikasite anplifikasyon?
Jodi a, nou pral mennen ou nan konsepsyon Jadendanfan qPCR ansanm, epi kite konsepsyon Jadendanfan qPCR vin yon konpetans lore efikas nan eksperyans.
Lè w ap desine primè qPCR, anjeneral, peye atansyon sou pwen sa yo: primè yo ta dwe fèt atravè entron otank posib, longè pwodwi a ta dwe 100-300 bp, valè Tm yo ta dwe pi pre ke posib a 60 ° C, ak primè yo en ak en yo ta dwe pi pre ke posib, ak fen Jadendanfan an ta dwe G oswa C, elatriye rete tann.
1. Konsepsyon primè ki kouvri entron
Lè w ap desine primè qPCR, chwazi primè ki fèt atravè entron yo ka anpeche modèl gDNA anplifye, ak pwodwi yo tout sòti nan anplifikasyon cDNA, kidonk elimine enfliyans kontaminasyon gDNA.
2. Longè premye
Longè Jadendanfan an se jeneralman ant 18-30 nt, ak longè pwodwi anplifikasyon an ta dwe kontwole ant 100-300 bp otank posib.
Si Jadendanfan an twò kout, li pral mennen nan anplifikasyon ki pa espesifik, epi si li twò lontan, li pral fasilman fòme estrikti segondè (tankou estrikti epengl).Si pwodwi anplifikasyon an twò lontan, li pa apwopriye pou reyaksyon polymerase, ki pral afekte efikasite PCR anplifikasyon.
3. Kontni GC ak valè Tm
Kontni GC nan primè yo ta dwe kontwole ant 40% ak 60%.Si li twò wo oswa twò ba, li pa fezab pou kòmanse reyaksyon an.Kontni GC nan primè pou pi devan ak ranvèse yo ta dwe tou pre menm bagay la pou yo ka jwenn menm valè Tm ak tanperati rkwit la.
Valè Tm a ta dwe ant 55-65 ° C osi lwen ke posib, jeneralman alantou 60 ° C, ak valè Tm nan en ak en yo ta dwe pi pre ke posib, de preferans pa plis pase 4 ° C.
4. Evite chwazi A nan fen 3′ Jadendanfan an
Lè fen 3′ nan Jadendanfan an pa matche, gen gwo diferans nan efikasite sentèz diferan baz yo.Lè dènye baz la se A, li kapab tou kòmanse sentèz chèn menm nan ka dezakò, epi lè dènye baz la se T Lè, efikasite nan endiksyon dezakò redwi anpil.Se poutèt sa, eseye evite chwazi A nan fen 3′ nan Jadendanfan an, epi li pi bon yo chwazi T.
Si se yon primè pwofonde, 5 'fen ankèt la pa ka G, paske menm lè yon sèl G baz konekte ak gwoup repòtè fluorescent FAM, G kapab tou pasè siyal fliyoresan emèt pa gwoup FAM la, sa ki lakòz fo rezilta negatif.Parèt.
5. Distribisyon baz
Distribisyon kat baz yo nan jadendanfan an se de preferans o aza, evite plis pase 3 youn apre lòt G oswa C nan fen 3′, ak plis pase 3 youn apre lòt.G oswa C yo fasil jenere pè nan rejyon an sekans GC ki rich.
6. Rejyon konsepsyon primè a ta dwe evite estrikti segondè konplèks.
Estrikti segondè ki fòme pa yon sèl strand nan pwodwi anplifikasyon an pral afekte pwogrè lis PCR la.Lè w prevwa si gen yon estrikti segondè nan sekans sib la davans, eseye evite rejyon sa a nan konsepsyon primè yo.
7. Jadendanfan yo tèt yo ak ant primè yo ta dwe eseye evite baz konsekitif konplemantè.
Pa ka gen okenn konplemantasyon konsekitif 4 baz ant Jadendanfan an tèt li ak Jadendanfan an.Jadendanfan nan tèt li pa ta dwe gen yon sekans konplemantè, otreman li pral pliye tèt li yo fòme yon estrikti epengl, ki pral afekte konbinezon an rkwir nan Jadendanfan an ak modèl la.
Sekans konplemantè pa ka egziste ant primè en ak en.Konplemantarite ant primè yo pral pwodwi dimè primè, ki pral diminye efikasite PCR e menm afekte presizyon quantitative.Si estrikti primè-dimè ak epeng cheve yo inevitab, valè △G pa ta dwe twò wo (ta dwe mwens pase 4.5 kcal/mol).
8. Jadendanfan yo anplifye pwodwi espesifik sib la.
Objektif final la nan deteksyon qPCR se konprann abondans jèn sib la.Si anplifikasyon ki pa espesifik rive, kantite a pral kòrèk.Se poutèt sa, apre yo fin fèt primè yo, yo bezwen teste pa BLAST, epi yo konpare espesifikasyon pwodwi yo nan baz done a sekans.
Apre sa, nou pran jèn imen GAS6 (Growth arrest specific 6) kòm yon egzanp pou konsepsyon primè qPCR.
01 rechèch jèn
Homo GAS6atravè NCBI.Isit la, nou ta dwe peye atansyon sou konpare non jèn yo ak espès yo asire yo ke yo konsistan.
02 Jwenn sekans jèn yo
(1) Si sekans sib la se ADN jenomik, chwazi premye a, ki se sekans ADN jenomik jèn nan.
(2) Si sekans sib la se mRNA, chwazi dezyèm lan.Apre w fin antre, klike sou "CDS" nan tablo ki anba a.Sekans background mawon an se sekans kodaj jèn nan.
03 Desine primè
Antre nan koòdone Primer-BLAST la
Antre nimewo sekans jèn oswa sekans nan fòma Fasta sou bò gòch anwo a, epi ranpli paramèt ki enpòtan yo.

Klike sou "Jwenn primè" ak NCBI ap parèt pou di w ke seleksyon paramèt sa yo pral anplifye nan lòt varyant splising.Nou ka tcheke diferan varyant splising yo epi soumèt yo pou jwenn pè Jadendanfan ki apwopriye a (jan yo montre nan figi ki anba a).Pwosesis sa a ka pran plizyè dizèn segonn pou kouri.
Tanperati rkwir pè jadendanfan sa yo se alantou 60 ° C.Dapre objektif la nan eksperyans la, chwazi primè ak longè modere, bon espesifik ak mwens pwòp tèt ou-konpleman nan primè yo pou eksperyans la, ak to siksè a se byen wo!
04Verifikasyon spesifik premye
An reyalite, anplis desine primè, Primer-Blast kapab evalye tou primè nou te kreye tèt nou.Retounen nan paj konsepsyon Jadendanfan an, antre nan primè en ak en nou te fèt, epi lòt paramèt yo pa pral ajiste.Apre w fin soumèt, ou ka wè si pè primè yo egziste tou sou lòt jèn.Si tout nan yo parèt sou jèn nan nou vle anplifye , ki endike ke espesifik nan pè sa a nan primè se gwo!(Pou egzanp, sa a se rezilta a sèlman nan rechèch la Jadendanfan!)

05 Primer jijman kalite
Ki kalite Jadendanfan se "pafè" Jadendanfan ki konbine "efikasite anplifikasyon jiska estanda", "karakteristik pwodwi anplifye", ak "rezilta eksperimantal serye"?
Efikasite anplifikasyon

koub k ap fonn
Efikasite anplifikasyon nan primè yo rive nan 90% -110%, ki vle di ke efikasite anplifikasyon an se yon bon bagay, ak koub la k ap fonn gen yon sèl pik epi anjeneral Tm> 80 ° C, ki vle di ke espesifik anplifikasyon an se yon bon bagay.
 
Pwodwi ki gen rapò:
Real Time PCR Easy–SYBR GREEN I
Real Time PCR Easy-Taqman