Teknoloji dyagnostik molekilè sèvi ak metòd byoloji molekilè pou detekte ekspresyon ak estrikti materyèl jenetik kò imen an ak divès kalite patojèn, pou reyalize objektif pou predi ak dyagnostik maladi.

Nan dènye ane yo, ak amelyorasyon ak iterasyon nan teknoloji dyagnostik molekilè, aplikasyon klinik la nan dyagnostik molekilè te vin pi plis ak plis vaste ak pwofondè, ak mache a dyagnostik molekilè te antre nan yon peryòd de devlopman rapid.

Otè a rezime teknoloji dyagnostik molekilè komen sou mache a, epi li divize an twa pati: premye pati a prezante teknoloji PCR, dezyèm pati a prezante teknoloji anplifikasyon izotèmik asid nikleyè, ak dezyèm pati a prezante teknoloji sekans.

01

Pati I: Teknoloji PCR

Teknoloji PCR

PCR (reyaksyon chèn polymerase) se youn nan teknoloji anplifikasyon ADN in vitro, ak yon istwa ki gen plis pase 30 ane.

Teknoloji PCR te pionnier an 1983 pa Kary Mullis nan Cetus, USA.Mullis te aplike pou yon patant PCR an 1985 e li te pibliye premye papye akademik PCR sou Syans nan menm ane a.Mullis te genyen Pri Nobèl nan Chimi an 1993.

Prensip debaz PCR

PCR ka anplifye fragman ADN sib pa plis pase yon milyon fwa.Prensip la se ke anba kataliz ADN polymerase, yo itilize ADN paran an kòm yon modèl, epi yo itilize yon Jadendanfan espesifik kòm pwen depa pou ekstansyon.Li se repwodui nan vitro atravè etap tankou denaturasyon, annealing, ak ekstansyon.Pwosesis ADN pitit fi a konplemantè ak ADN modèl paran an.

Pwosesis PCR estanda a divize an twa etap:

1. Denaturation: Sèvi ak tanperati ki wo pou separe fil doub ADN.Lyezon idwojèn ki genyen ant fil doub ADN yo kase nan tanperati ki wo (93-98 ° C).

2. Recuit: Apre yo fin separe ADN doub-bloke, tanperati a bese pou Jadendanfan an ka mare ak ADN sèl-chache la.

3. Ekstansyon: ADN polymerase a kòmanse fè sentèz fil konplemantè sou fil ADN ki soti nan primè yo mare lè tanperati a bese.Lè ekstansyon an fini, yon sik fini, ak kantite fragman ADN double.

Resipwòk twa etap sa yo 25-35 fwa, kantite fragman ADN ap ogmante eksponansyèlman.

Enjenyeu PCR la se ke diferan primè yo ka fèt pou diferan jèn sib, se konsa ke fragman yo jèn sib yo ka anplifye nan yon kout peryòd de tan.

Jiskaprezan, PCR ka divize an twa kategori, sètadi PCR òdinè, PCR quantitative fluorescent ak PCR dijital.

Premye jenerasyon PCR òdinè

Sèvi ak yon enstriman anplifikasyon PCR òdinè pou anplifye jèn sib la, epi sèvi ak elektwoforèz jèl agarose pou detekte pwodwi a, se sèlman analiz kalitatif yo ka fè.

Dezavantaj prensipal yo nan premye jenerasyon PCR la:

-Tandans pou anplifikasyon ki pa espesifik ak fo rezilta pozitif.

-Deteksyon an pran yon bon bout tan ak operasyon an ankonbran.

-Sèlman kalitatif tès ka fè.

Dezyèm jenerasyon fluoresans PCR quantitative

Fluoresan PCR quantitative (Real-Time PCR), ke yo rele tou qPCR, yo itilize pou kontwole akimilasyon an nan pwodwi anplifye nan akimilasyon nan siyal fliyoresan lè yo ajoute sond fliyoresan ki ka endike pwogrè nan sistèm reyaksyon an, ak jije rezilta yo atravè koub la fluoresans, epi li ka quantifye avèk èd nan valè Cq ak koub estanda.

Paske teknoloji qPCR la te pote soti nan yon sistèm fèmen, pwobabilite pou kontaminasyon redwi, epi siyal fluoresans la ka kontwole pou deteksyon quantitative, kidonk li se pi lajman itilize nan pratik klinik e li te vin teknoloji dominan nan PCR.

Sibstans fliyoresan yo itilize nan PCR quantitative fliyoresan an tan reyèl yo ka divize an: TaqMan sond fliyoresan, limyè molekilè ak koloran fliyoresan.

1) Sond fliyoresan TaqMan:

Pandan anplifikasyon PCR, yo ajoute yon pwofonde fliyoresan espesifik pandan y ap ajoute yon pè primè.Pwofonde a se yon oligonukleotid, ak de bout yo respektivman make ak yon gwoup fliyoresan repòtè ak yon gwoup fliyoresan quencher.

Lè sond la entak, siyal fliyoresan ki emèt pa gwoup repòtè a absòbe gwoup trempe a;pandan anplifikasyon PCR, aktivite eksonukleaz 5′-3′ nan anzim Taq fende ak degrade pwofonde a, fè gwoup fliyoresan repòtè a ak quencher gwoup fliyoresan separe, pou sistèm siveyans fliyoresan an ka resevwa siyal fliyoresan, se sa ki, chak fwa yon fil ADN anplifye, se yon siyal fluorescent akimile fòmasyon fliyoresan. pwodwi PCR la.

2) koloran fliyoresan SYBR:

Nan sistèm reyaksyon PCR la, yo ajoute yon eksè koloran fliyoresan SYBR.Apre lank fliyoresan SYBR la ki pa espesifikman enkòpore nan doub-strand ADN, li emèt yon siyal fliyoresan.Molekil lank SYBR ki pa enkòpore nan chèn lan pa pral emèt okenn siyal fliyoresan, kidonk asire siyal fliyoresan Ogmantasyon nan pwodwi PCR yo konplètman senkronize ak ogmantasyon nan pwodwi PCR.SYBR sèlman mare ak ADN doub, kidonk koub k ap fonn lan ka itilize pou detèmine si reyaksyon PCR la espesifik.

3) Beacons molekilè

Li se yon tij-bouk doub-etikèt sond oligonukleotid ki fòme yon estrikti epengl nan apeprè 8 baz nan 5 ak 3 bout yo.Sekans asid nikleyik nan tou de bout yo konplemantèman pè, sa ki lakòz gwoup la fliyoresan ak gwoup la trempe yo dwe sere.Fèmen, li pa pral pwodwi fliyoresans.

Apre yo fin pwodwi PCR pwodwi a, pandan pwosesis la annealing, se pati mitan an nan molekilè Beacon la pè ak yon sekans ADN espesifik, ak jèn fliyoresan an separe de jèn nan quencher pou pwodwi fluoresans.

Dezavantaj prensipal yo nan dezyèm jenerasyon PCR:

Sansiblite toujou manke, ak deteksyon an nan espesimèn ki ba-kopi pa egzat.

Gen enfliyans valè background, ak rezilta a se sansib a entèferans.

Twazyèm jenerasyon PCR dijital

Digital PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) kalkile nimewo kopi sekans sib la atravè deteksyon pwen final, epi li ka fè deteksyon egzat quantitative absoli san yo pa itilize kontwòl entèn ak koub estanda.

PCR dijital sèvi ak deteksyon pwen final epi li pa depann de valè Ct (papòt sik), kidonk reyaksyon PCR dijital la mwens afekte pa efikasite anplifikasyon, ak tolerans pou inhibiteur reyaksyon PCR amelyore, ak presizyon segondè ak repwodiksyon.

Akòz karakteristik sa yo nan sansiblite segondè ak presizyon segondè, li pa fasil entèfere pa inhibiteur reyaksyon PCR, epi li ka reyalize vre quantifikasyon absoli san pwodwi estanda, ki te vin tounen yon rechèch ak aplikasyon otspo.

Dapre diferan fòm inite reyaksyon an, li ka divize an twa kalite: sistèm mikrofluidik, chip ak ti gout.