Valè Ct se fòm prezantasyon rezilta ki pi enpòtan nan PCR quantitative fluorescent.Yo itilize li pou kalkile diferans ekspresyon jèn oswa nimewo kopi jèn.Se konsa, ki valè Ct nan quantifikasyon fluoresans konsidere kòm rezonab?Ki jan yo asire seri a efikas nan valè Ct?
Ki sa ki valè Ct?
Pandan pwosesis anplifikasyon qPCR la, kantite sik anplifikasyon ki koresponn lan (Sik Papòt) lè siyal fliyoresan pwodwi anplifye a rive nan papòt fliyoresans fikse.C la vle di Cycle ak T la vle di Threshold.Senpleman mete, valè Ct la se kantite sik ki koresponn ak lè anplifikasyon modèl inisyal la rive nan yon sèten kantite pwodwi nan qPCR.Sa yo rele "yon sèten kantite pwodwi" yo pral plis eksplike pita.
Kisa valè Ct fè?
1.Relasyon ant anplifikasyon eksponansyèl, kantite modèl ak valè Ct
Idealman, jèn nan qPCR yo akimile pa anplifikasyon eksponansyèl apre yon sèten kantite sik.Relasyon ant kantite sik anplifikasyon ak kantite pwodwi yo se: Kantite pwodwi anplifye = kantite modèl inisyal × (1+En) nimewo sik.Sepandan, reyaksyon qPCR la pa toujou nan yon sitiyasyon ideyal.Lè kantite pwodwi anplifye rive nan yon "sèten kantite pwodwi", kantite sik nan moman sa a se valè Ct, epi li se nan peryòd anplifikasyon eksponansyèl la.Relasyon ki genyen ant valè Ct ak kantite modèl kòmanse: Gen yon relasyon lineyè ant valè Ct modèl la ak logaritm nimewo kopi kòmanse modèl la.Pi wo konsantrasyon modèl inisyal la, se pi piti valè Ct la;pi ba konsantrasyon modèl inisyal la, se pi gwo valè Ct la.
2.Anplifikasyon koub, papòt fluoresans ak sèten kantite pwodwi PCR
Kantite pwodwi anplifikasyon qPCR dirèkteman prezante nan fòm siyal fliyoresan, se sa ki, koub anplifikasyon an.Nan etap bonè nan PCR, anplifikasyon an se nan kondisyon ideyal, kantite sik la piti, akimilasyon pwodwi a piti, ak nivo fliyoresans pa ka klèman distenge ak background nan fliyoresan.Apre sa, fliyoresans la ogmante epi antre nan faz eksponansyèl la.Ka kantite pwodwi PCR dwe detekte nan yon sèten pwen lè reyaksyon PCR la jis nan faz eksponansyèl la, ki ka itilize kòm "yon sèten kantite pwodwi", epi yo ka dedwi kontni inisyal la nan modèl la.Se poutèt sa, entansite siyal fluoresans ki koresponn ak yon sèten kantite pwodwi se papòt fluoresans la.
Nan etap an reta nan PCR, koub anplifikasyon an pa montre anplifikasyon eksponansyèl ankò, epi li antre nan faz lineyè ak faz plato.
3.Reproducibility nan valè Ct
Lè sik PCR la rive nan nimewo sik la nan valè Ct, li te jis antre nan peryòd anplifikasyon eksponansyèl vre.Nan moman sa a, ti erè a pa te anplifye, kidonk repwodiksyon nan valè Ct ekselan, se sa ki, se menm modèl la anplifye nan diferan moman oswa nan tib diferan an menm tan an.Anplifikasyon, valè Ct yo jwenn konstan.
1.Anplifikasyon efikasite En
Efikasite anplifikasyon PCR refere a efikasite ak ki polymerase a konvèti jèn yo dwe anplifye nan yon anplikon.Efikasite anplifikasyon lè yon molekil ADN transfòme nan de molekil ADN se 100%.Efikasite anplifikasyon souvan eksprime kòm En.Yo nan lòd yo fasilite analiz la nan atik ki vin apre yo, faktè sa yo ki afekte efikasite nan anplifikasyon yo yon ti tan prezante.
| Faktè ki enfliyanse | eksplikasyon | Ki jan yo jije? |
| A. Inibitè PCR | 1. ADN modèl la gen sibstans ki anpeche reyaksyon PCR la, tankou pwoteyin oswa detèjan.2. cDNA a apre transcription ranvèse gen yon gwo konsantrasyon nan konpozan RNA modèl oswa RT reyaktif, ki ka tou anpeche reyaksyon PCR ki vin apre a. | 1. Si gen polisyon ka jije pa mezire rapò a nan A260 / A280 ak A260 / A230 oswa elektwoforèz RNA.2. Kit cDNA a dilye dapre yon sèten rapò apre transcription ranvèse. |
| B. Move konsepsyon Jadendanfan | Primers pa rkwit avèk efikasite | Tcheke primè pou primè-dimè oswa epeng cheve, dezakò, epi pafwa spanning desen entwonik. |
| C. Move konsepsyon pwogram reyaksyon PCR | 1. Primers pa ka efektivman rkwit2. Ensifizan lage ADN polymerase 3. Alontèm segondè tanperati ADN polymerase aktivite diminye | 1. Tanperati recuit pi wo pase valè TM Jadendanfan an2. Tan pre-denaturasyon twò kout 3. Tan chak etap nan pwosedi reyaksyon an twò lontan |
| D. Ensifizan melanje reyaktif oswa erè pipet | Nan sistèm reyaksyon an, konsantrasyon lokal konpozan reyaksyon PCR twò wo oswa inegal, sa ki lakòz anplifikasyon ki pa eksponansyèl PCR. | |
| E. Longè anplikon | Longè anplifikasyon an twò lontan, depase 300bp, ak efikasite anplifikasyon an ba | Tcheke ke longè anplikon an se ant 80-300bp |
| F. Enfliyans reyaktif qPCR | Konsantrasyon ADN polymerase nan reyaktif la ba oswa konsantrasyon iyon nan tanpon an pa optimize, sa ki lakòz aktivite anzim Taq la pa rive nan maksimòm. | Detèminasyon efikasite anplifikasyon pa koub estanda |
2.Range nan Ct valè
Valè Ct varye ant 15-35.Si valè Ct a se mwens pase 15, li konsidere ke anplifikasyon an se nan seri a nan peryòd debaz la ak papòt la fliyoresan pa te rive jwenn.Idealman, gen yon relasyon lineyè ant valè Ct ak logaritm nimewo kopi inisyal modèl la, se sa ki koub estanda a.Atravè koub estanda a, lè efikasite anplifikasyon an se 100%, valè Ct kalkile pou quantifier nimewo kopi sèl nan jèn nan alantou 35. Si li pi gran pase 35, nimewo kopi inisyal modèl la se teyorikman mwens pase 1, ki ka konsidere kòm san sans.
Pou diferan chenn jèn Ct, akòz diferans nan nimewo kopi jèn ak efikasite anplifikasyon nan kantite modèl inisyal la, li nesesè pou fè yon koub estanda pou jèn nan epi kalkile seri deteksyon lineyè jèn la.
3.Faktè ki enfliyanse valè Ct
Soti nan relasyon ki genyen ant kantite sik anplifikasyon ak kantite pwodwi: kantite pwodwi anplifye = kantite modèl inisyal × (1 + En) nimewo sik, li ka wè ke nan kondisyon ideyal, kantite a nan modèl inisyal ak En pral gen yon enpak negatif sou valè Ct afekte.Diferans nan bon jan kalite modèl oswa efikasite anplifikasyon pral lakòz valè Ct a twò gwo oswa twò piti.
4.Ct valè a twò gwo oswa twò piti
Tan poste: Feb-22-2023
