PCR se teknoloji anplifikasyon asid nikleyik ki pi lajman itilize epi li lajman itilize akòz sansiblite li yo ak espesifik.Sepandan, PCR mande pou repete denaturasyon tèmik epi yo pa ka debarase m de limit yo nan konte sou enstriman ak ekipman, ki limite aplikasyon li nan tès jaden klinik.

Depi kòmansman ane 1990 yo, anpil laboratwa yo te kòmanse devlope teknoloji anplifikasyon tanperati konstan ki pa mande pou denaturasyon tèmik.Koulye a, yo te devlope teknoloji anplifikasyon izotèmik bouk-medyatè, teknoloji anplifikasyon izotèmik ranplasman strand, teknoloji anplifikasyon izotèmik woule sèk, ak depandans sekans asid nikleyik.Teknoloji anplifikasyon izotèmik ak lòt teknoloji. 

Loop-medyatè anplifikasyon izotèmik

Prensip anplifikasyon an baze sou lefèt ke ADN nan yon eta ekilib dinamik nan apeprè 65 ° C.Lè nenpòt primè baz-pè ak pwolonje nan pati konplemantè nan doub-bloke ADN, lòt strand la pral disoye epi vin yon sèl-bloke.

Nan tanperati sa a, ADN itilize 4 primè espesifik pou konte sou yon polymerase ADN deplasman strand pou fè sentèz ADN deplasman strand sikile kontinyèlman.

Premyèman detèmine 6 rejyon espesifik F3, F2, F1, B1, B2, B3 sou jèn sib la, epi answit konsepsyon 4 primè ki baze sou 6 rejyon espesifik sa yo (jan yo montre nan figi ki anba a):

Jadendanfan anndan an pi devan (FIP) konpoze de F1c ak F2.

Jadendanfan anndan an bak (BIP) konpoze de B1c ak B2, epi TTTT yo itilize kòm yon espas nan mitan an.

Primè ekstèn F3 ak B3 yo konpoze respektivman de rejyon F3 ak B3 sou jèn sib la.

Nan sistèm nan reyaksyon LAMP, konsantrasyon nan Jadendanfan enteryè a se plizyè fwa sa yo ki nan Jadendanfan ekstèn lan.Jadendanfan anndan an premye konbine avèk modèl la pou fè sentèz yon fil konplemantè pou fòme yon doub ADN.Imedyatman, se Jadendanfan ekstèn lan konbine avèk fil modèl la pou fòme yon strand doub ADN.Anba aksyon an nan BstDNA polymerase, se fil konplemantè sentèz pa Jadendanfan anndan an lage.Apre yon seri de reyaksyon, fil konplemantè a finalman fòme yon sèl fil ADN ak yon estrikti altèr.

Altèr estrikti ADN yon sèl strand tèt li itilize kòm yon modèl kontinyèlman fòme yon tranzisyon tij-bouk ADN estrikti ak yon fen louvri.Primè enteryè ak ekstèn yo gide ADN estrikti tranzisyon tij-bouk la pou kontinye sibi deplasman strand ak reyaksyon ekstansyon, epi finalman fòme estrikti tij-bouk miltip ak longè diferan.melanj ADN.

Avantaj ak dezavantaj nan bouk-medyatè anplifikasyon izotèmik

Avantaj nan LAMP:

(1) Segondè efikasite anplifikasyon, ki ka efektivman anplifye 1-10 kopi jèn sib la nan 1h, ak efikasite anplifikasyon se 10-100 fwa PCR òdinè.

(2) Tan reyaksyon an kout, espesifikasyon an fò, epi pa gen okenn ekipman espesyal ki nesesè.

Enpèfeksyon nan LAMP:

(1) Kondisyon pou primè yo patikilyèman wo.

(2) Pwodwi anplifye a pa ka itilize pou klonaj ak sekans, men li ka itilize sèlman pou jijman.

(3) Akòz sansiblite fò li yo, li fasil pou fòme ayewosòl, sa ki lakòz fo pozitif ak afekte rezilta tès yo.

Strand deplasman anplifikasyon

Strand displacement anplifikasyon (SDA) se yon teknik anplifikasyon ADN izotèmik in vitro ki baze sou reyaksyon anzimatik premye pwopoze pa yon etidyan Ameriken Walker an 1992.

Sistèm debaz SDA a gen ladan yon endonukleaz restriksyon, yon ADN polymerase ak aktivite deplasman strand, de pè primè, dNTP, ak iyon kalsyòm ak mayezyòm ak sistèm tanpon.

Prensip anplifikasyon deplasman strand la baze sou sekans rekonesans endonukleaz restriksyon chimikman modifye nan tou de bout ADN sib la.Endonukleaz la louvri espas sa a nan ADN seksyon an nan sit rekonesans li yo, ak ADN polymerase a pwolonje espas sa a 3′ Fen epi ranplase pwochen strand ADN la.

Seliman ADN ranplase yo ka konbine avèk primè epi pwolonje an doub fil pa DNA polymerase.Pwosesis sa a repete kontinyèlman, se konsa ke sekans sib la efikasman anplifye.

Avantaj ak dezavantaj nan teknoloji anplifikasyon deplasman strand

Avantaj nan SDA:

Efikasite anplifikasyon an wo, tan reyaksyon an kout, espesifikasyon an fò, epi pa gen okenn ekipman espesyal ki nesesè.

Enpèfeksyon nan SDA:

Pwodwi yo pa inifòm, ak kèk pwodwi sèl-bloke ak doub-bloke yo toujou pwodwi nan sik la SDA, ak tailing pral inevitableman rive lè detekte pa elektwoforèz.

Rolling sèk anplifikasyon

Rolling circle anplifikasyon (RCA) pwopoze pa fè desen sou metòd pou kopye ADN nan òganis patojèn pa woule sèk.Li refere a itilizasyon ADN sikilè sèl-chèn kòm yon modèl nan yon tanperati konstan, ak yon polymerase ADN espesyal (tankou Phi29) ) Anba aksyon an nan sentèz ADN woule sèk reyalize anplifikasyon jèn sib la.

RCA ka divize an anplifikasyon lineyè ak anplifikasyon eksponansyèl.Efikasite lineyè RCA ka rive jwenn 10⁵fwa, ak efikasite nan RCA eksponansyèl ka rive nan 10⁹fwa.

Senp distenksyon, jan yo montre nan figi ki anba a, anplifikasyon lineyè a sèlman itilize 1 primè, anplifikasyon eksponansyèl b gen 2 primè.

Lineyè RCA yo rele tou sèl RCA Jadendanfan.Yon primè mare ak ADN sikilè epi li pwolonje pa aksyon ADN polymerase.Pwodwi a se yon sèl fil lineyè ak yon gwo kantite sekans repetitif dè milye de fwa longè yon sèl bouk.

Depi pwodwi lineyè RCA toujou konekte ak premye a kòmanse, fikse fasil siyal la se yon gwo avantaj.

Eksponansyèl RCA, ke yo rele tou Hyper branche anplifikasyon HRCA (Hyper branch RCA), nan eksponansyèl RCA, yon sèl primè anplifye pwodwi RCA a, dezyèm primè a ibrid ak pwodwi RCA a epi li pwolonje, ak ranplasman an deja mare nan pwodwi RCA a.

Avantaj ak dezavantaj nan woule sèk anplifikasyon asid nikleyè

Avantaj nan RCA:

Segondè sansiblite, bon espesifik ak operasyon fasil.

Enpèfeksyon nan RCA:

Pwoblèm background pandan deteksyon siyal.Pandan reyaksyon RCA a, pwofonde kadna ki pa sikile a ak modèl ADN oswa RNA sond ki pa konekte a ka jenere kèk siyal background. 

Nanplifikasyon ki baze sou sekans ucleicacid

Anplifikasyon ki baze sou sekans asid nukleik (NASBA) se yon nouvo teknoloji devlope sou baz PCR.Li se yon anplifikasyon kontinyèl ak izotèmik asid nikleyè ki gide pa yon pè primè ak yon sekans pwomotè T7.Teknoloji a ka anplifye modèl RNA a apeprè 109 fwa nan apeprè 2 èdtan, ki se 1000 fwa pi wo pase metòd PCR konvansyonèl la epi li pa mande pou ekipman espesyal.

Teknoloji sa a te itilize pou dyagnostik rapid maladi le pli vit ke li parèt, ak anpil konpayi kounye a itilize metòd sa a nan twous deteksyon RNA.

Malgre ke RNA anplifikasyon kapab tou itilize ranvèse transkripsyon PCR teknoloji, NASBA gen avantaj pwòp li yo: li ka te pote soti nan kondisyon tanperati relativman konstan, epi li pi estab ak egzat pase teknoloji PCR tradisyonèl yo.

Reyaksyon an se nan 41 degre Sèlsiyis epi li mande pou AMV (viris mieloblastoz avyè) transkriptaz ranvèse, RNase H, T7 RNA polymerase ak yon pè primè pou konplete.

Pwosesis la sitou gen ladan:

Jadendanfan pi devan an gen sekans konplemantè pwomotè T7 la.Pandan reyaksyon an, primè pi devan an mare nan strand RNA a epi li katalize pa anzim AMV la pou fòme yon doub strand ADN-RNA.

RNase H dijere RNA a nan ibrid doub-seksyon an epi li kenbe ADN nan yon sèl-chachen.

Anba aksyon Jadendanfan ranvèse a ak anzim AMV a, yo fòme yon doub fil ADN ki gen sekans pwomotè T7 la.

Anba aksyon T7 RNA polymerase, pwosesis transkripsyon an fini epi yo pwodui yon gwo kantite RNA sib.

Avantaj NASBA:

(1) Jadendanfan li a gen yon sekans pwomotè T7, men ADN etranje doub-chèn pa gen okenn sekans pwomotè T7 epi li pa ka anplifye, kidonk teknoloji sa a gen gwo espesifik ak sansiblite.

(2) NASBA dirèkteman enkòpore pwosesis transkripsyon ranvèse a nan reyaksyon anplifikasyon an, diminye tan reyaksyon an.

Dezavantaj NASBA:

(1) Konpozan reyaksyon yo pi konplike.

(2) Twa kalite anzim obligatwa pou fè pri reyaksyon an pi wo.