RT-qPCR se eksperyans debaz nan byoloji molekilè, epi tout moun dwe abitye avèk li.Li sitou gen ladan twa etap: ekstraksyon RNA, transkripsyon ranvèse nan cDNA, ak an tan reyèl fluoresan PCR quantitative.Li pa ede, kisa k ap pase?Li posib ke gen yon pwoblèm akeksperyans nan transcription ranvèse!Malgre ke li sanble ke eksperyans nan transcription ranvèse sèlman bezwen ajoute RNA, dNTP, primè, aktranskriptaz ranvèsenan tib santrifijeur a epi melanje byen, men nan pwosesis operasyon aktyèl la, toujou gen anpil detay ki bezwen peye atansyon a.Ann aprann sou li!

Ki jan yo jije bon jan kalite a nan RNA?
Pou jwenn cDNA, kalite RNA enpòtan anpil!Kalite RNA ka detekte sitou nan de aspè:
(1) Entegrite RNA:Entegrite RNA ka verifye pa elektwoforèz jèl agarose. Lè w pran ekaryot kòm egzanp, RNA total konplè a gen twa gwoup klè, pwa molekilè yo soti nan gwo rive nan ti se 28S, 18S, ak 5S, ak 28S se de fwa pi klere ke 18S;si twa gwoup yo ka wè, men kalite gwoup la twoub oswa Difizyon vle di ke RNA a pasyèlman degrade.Nan moman sa a, tanpri fè reyaksyon an transcription ranvèse imedyatman epi ogmante opinyon modèl la kòmsadwa;si se sèlman yon gwoup ki gen yon ti pwa molekilè oswa pa gen okenn gwoup ka wè, RNA a te konplètman degrade epi li bezwen re-extrait.Agilent 2100 endike entegrite RNA ak dyagram pik ak valè RIN.Si asid nikleyik la entak, liy debaz elektwoferogram la plat;si asid nikleyik la degrade grav, liy debaz la inegal ak plis pik degradasyon parèt;valè RIN reflete entegrite RNA a, nan seri 0-10, pi gwo valè a, pi bon kalite RNA a.Oke, pi wo a degre nan konplè.
(2) Pite RNA:Rapò a nan OD260/280 ka detekte pa UV spectrophotometry.Si rapò OD260/280 se ant 1.9 ak 2.1, pite a trè bon.
ADN jenomik rezidyèl ka mennen nan rezilta quantitative ki pa kòrèk
Lè RNA yo ekstrè, RNA nou jwenn yo ka melanje ak ADN jenomik (gDNA) ki pa te netwaye.Se poutèt sa, cDNA a apre transcription ranvèse pral tou melanje akgDNA.Pandan en aqPCRreyaksyon,cDNAak gDNA ka anplifye ansanm, sa ki lakòz yon valè CT relativman ti, kidonk rezilta yo ka patipri.
Se konsa, ki sa nou ta dwe fè nan sitiyasyon sa a?Foregenesijere:
(1) Fè netwayaj genomic sou RNA ranvèse a, ki ka retire pa ekstraksyon kolòn pandan ekstraksyon RNA;
(2) Trete RNA ekstrè a ak DNaseI , men mete fen nan li ak EDTA;
nan reyaktif transkripsyon ranvèseak modil netwaye genòm;

Ki jan yo chwazi primè pou transcription ranvèse?
Primè transcription ranvèse tou afekte rezilta nan reyaksyon an transcription inverse.Ou ka chwazi primè o aza, Oligo dT oswa primè espesifik jèn pou transkripsyon ranvèse selon sikonstans espesifik eksperyans la:
(1) Transkripsyon espesifik: yo rekòmande premye jèn espesifik;
(2) Transkripsyon fragman long: Oligo dT/jene-espesifik primè yo rekòmande;
(3) Fragman entèn nan relve nòt long segman yo: jèm-espesifik primè/Primers o aza /Primers o aza + Oligo dT.Si yo fè eksperyans qPCR ki vin apre a, Oligo dT pa ka itilize pou kont li, paske lè l sèvi avèk Oligo dT pou kont li ka lakòz 3 'fen patipri, ki mennen nan rezilta egzak eksperyans qPCR;
(4) miRNA: Yo ka itilize primè tij-bouk oswa primè tailing.

Konbyen fwa yo ta dwe dilye pwodwi transkripsyon ranvèse cDNA a pou quantification?
Apre w fin jwenn cDNA nan pwodwi transkripsyon ranvèse a, konbyen fwa cDNA yo ta dwe dilye pou eksperyans qPCR trè enpòtan.Si konsantrasyon cDNA a twò wo oswa twò ba, efikasite anplifikasyon an ka afekte.Èske yo ka mezire konsantrasyon cDNA a, epi ki jan li ta dwe fè?
(1) Konsantrasyon cDNA pwodwi transkripsyon ranvèse a pa ka mezire, paske anplis pwodwi cDNA, pwodwi transcription ranvèse tou gen tanpon rezidyèl transkripsyon ranvèse, transkriptaz ranvèse, primè, elatriye, ki pral entèfere ak rezilta mezi konsantrasyon yo epi lakòz OD260/280, OD260/230 rapò pa nòmal e se poutèt sa pa reflete vrè cDNA.Nan moman sa a, kèk zanmi pral di, Lè sa a, mwen pral mezire konsantrasyon an apre pirifikasyon;isit la, Foregene ta renmen raple ke cDNA a pa rekòmande pou pirifye, paske longè cDNA yo jwenn pa ranvèse a diferan, epi kout cDNA a ap pèdi nan pirifikasyon an.
(2) Ki sa pou w fè?Anvan eksperyans qPCR la, yo ka detèmine gradyan dilution cDNA a atravè eksperyans anvan an.Pou egzanp: sèvi ak solisyon stock cDNA, 10-pliye dilution, ak 100-pliye dilution kòm modèl pou eksperyans qPCR, epi chwazi faktè a dilution ak yon valè CT nan seri a nan 18-28.

Ki jan miRNA yo ta dwe transkri inverse?
miRNA se yon ti molekil RNA ki gen yon sèl chenn ak yon gwosè apeprè 22 nt ki pa kòde pou pwoteyin.Akòz longè kout li yo, metòd qPCR konvansyonèl yo difisil pou dirèkteman quantifier li, kidonk li souvan nesesè pou pwolonje miRNA;metòd transkripsyon ranvèse yo souvan itilize pou miRNA gen ladan metòd tij-bouk ak metòd tailing.
Metòd tij-bouk la se pou yon ekstansyon pou miRNA a lè w ajoute primè tij-bouk.Metòd deteksyon sa a gen pi wo sansiblite ak espesifik, men debi deteksyon an ba.Yon transkripsyon ranvèse ka sèlman detekte yon sèl miRNA ak yon referans entèn;se metòd la ke-ajoute ki konpoze de de Li se konplete pa aksyon an jwenti nan de anzim, ki se PolyA polymerase ak transkriptaz ranvèse.PolyA polymerase responsab pou ajoute ke PolyA nan miRNA pou ogmante longè li yo, epi transkriptaz ranvèse fè reyaksyon transkripsyon ranvèse.Metòd sa a gen gwo debi deteksyon epi li ka detekte plizyè miRNA ak referans entèn nan yon sèl transcription ranvèse, men sansiblite a ak espesifik yo ba nan metòd la tij-bouk.