PCR, miltip PCR, PCR sou sit, PCR ranvèse, RT-PCR, qPCR（1）–PCR

Nou pral regle konsèp, etap ak detay divès kalite PCR

Ⅰ. PCR

Polymerase Chain Reaction, yo rele PCR, se yon teknoloji byolojik molekilè ki itilize pou elaji fragman ADN espesifik.Li ka konsidere kòm yon replikasyon ADN espesyal nan vitro.ADN polymerase (DNA Polymerase I) te dekouvri osi bonè ke lè 1955, ak Klenow Fragman nan E. Coli, ki gen valè eksperimantal ak pratik, te dekouvri pa Dr H. Klenow nan kòmansman ane 1970 yo, men paske anzim sa a pa tolere tanperati a, tanperati ki wo ka dejenere li, kidonk li pa satisfè reyaksyon polymerase segondè tanperati a.Anzim yo itilize jodi a (yo rele Taq polymerase), yo te izole nan Thermus aquaticus, yon bakteri sous dlo cho an 1976. Karakteristik li se ke li ka reziste tanperati ki wo epi li se yon anzim ideyal, men li se lajman itilize apre ane 1980 yo.Konsèp orijinal la nan orijinal pwototip primitif PCR la sanble ak reparasyon jèn ak kopi, ki te pwopoze pa Dr KJell Kleppe an 1971. Li te pibliye premye kopi jèn senp ak kout tèm (menm jan ak de premye reyaksyon sik PCR).Doktè Kary B. Mullis te devlope PCR jodi a an 1983. Doktè Mullis te sèvi konpayi PE ane sa a, kidonk PE gen yon estati espesyal nan endistri PCR la.Doktè Mullis ofisyèlman pibliye premye papye ki gen rapò ak Saiki ak lòt moun nan lane 1985. Depi lè sa a, itilizasyon PCR se dè milye de mil pa jou, epi bon jan kalite papye ki gen rapò yo ka fè anpil lòt metòd rechèch dezagreyab.Imedyatman, teknoloji PCR lajman itilize nan rechèch byolojik syantifik ak aplikasyon klinik, vin teknoloji ki pi enpòtan nan rechèch byoloji molekilè.Mullis tou te genyen 1993 Nobel Prize nan Chimi.

PCRPrensip

Prensip debaz teknoloji PCR la sanble ak pwosesis replikasyon natirèl ADN, e espesifik li depann de primè oligonukleotid ki konplemantè ak tou de bout sekans sib la.PCR konpoze de dejenerasyon-annealing-pwolonje twa etap reyaksyon debaz: ①Dejenerasyon nan ADN modèl: Apre ADN modèl la chofe a apeprè 93 ° C pou yon sèten peryòd tan, solisyon an doub ADN pou ADN doub chèn ki te fòme pa anplifikasyon PCR nan ADN modèl Kite, fè li yon sèl chèn pou li ka prepare yon sèl chèn pou pwochen reyaji a.②Annealing (konpoze) nan ADN modèl la ak Jadendanfan an: Apre ADN modèl la chofe ak dejenere nan yon sèl chèn, tanperati a desann nan apeprè 55 ° C.Sekans konplemantè Jadendanfan an ak modèl ADN yon sèl-chèn.③ Ekstansyon Jadendanfan an: modèl ADN - Liaison Jadendanfan an baze sou aksyon TaqDNA polymerase, ak dNTP kòm materyèl bwit reyaksyon.Kenbe prensip replikasyon an, sentèz yon nouvo chèn kopi semi-rezerve ki konplete chèn ADN modèl la, epi repete sik koripsyon-annealing-ekstansyon twa pwosesis ka jwenn plis "chèn kopi semi-rezève", ak nouvo chèn sa a disponib ankò Vin yon modèl pou pwochen sik la.Li pran 2-4min pou konplete bouk la, jèn sib la ka anplifye plizyè milyon fwa nan 2-3 èdtan.

EstandaPCRSistèm reyaksyon

Senk eleman nan reyaksyon PCR

Gen sitou senk kalite sibstans ki enplike nan reyaksyon PCR, sètadi Jadendanfan, anzim, dNTP, modèl ak tanpon (Mg2 + obligatwa).[PCR pwosedi]

Pwosesis PCR estanda a divize an twa etap

1. ADN koripsyon (90 ° C-96 ° C): modèl ADN doub-chèn anba aksyon tèmik, lyezon idwojèn kraze, fòme yon ADN sèl-chèn.

2. Recuit (25 ℃ -65 ℃): Tanperati sistèm lan redwi, Jadendanfan an konbine avèk modèl ADN pou fòme yon chèn doub lokal.

3. Ekstansyon (70 ℃ -75 ℃): Anba aksyon an nan anzim Taq (apeprè 72 ° C, aktivite ki pi bon), dNTP yo itilize kòm materyèl la anvan tout koreksyon, pwolonje soti nan 5 'fen nan jadendanfan → 3' fen, sentèz ak modèl konpleman youn ak lòt chèn ADN.

Chak sik se denatire, rkwit ak pwolonje, double kontni an ADN.Koulye a, akòz zòn nan anplifikasyon kout, kèk PCR ka repwodui nan yon tan trè kout menm si aktivite anzim Taq la pa pi bon, kidonk li ka chanje nan de etap, se sa ki, rkwit la ak ekstansyon ka fèt nan 60 ° C-65 ° C an menm tan an.Yo nan lòd yo diminye pwosesis la nan leve ak refwadisman ak amelyore vitès la repons.

Karakteristik reyaksyon PCR

● Segondè-Spesifik

Faktè espesifik desizif repons PCR yo se: ①Konbinezon espesifik Jadendanfan an ak ADN modèl la.② Prensip la nan pè baz.③Lwayote a nan reyaksyon sentèz TaqDNA polymerase la.④ Espesifik ak konsèvativ jèn sib la.

Konbinezon ki kòrèk la nan primè ak modèl se kle a.Liaison Jadendanfan an ak modèl la ak ekstansyon chèn Jadendanfan an baze sou prensip matche baz alkalin.Lwayote a nan reyaksyon sentèz polymerase ak rezistans nan tanperati ki wo nan Taq ADN polymerase a fè obligatwa (konpoze) nan modèl la ak Jadendanfan nan reyaksyon an ka fèt nan yon tanperati ki pi wo.Espesifik nan konbinezon an ogmante anpil.Clip la ka kenbe yon wo degre de kòrèk.Lè w chwazi yon rejyon jenetik sib ak konsèvativ segondè ak konsèvativite segondè, espesifik li pi wo.

● Segondè sansiblite

Volim pwodiksyon pwodwi PCR ogmante pa endèks, sa ki ka elaji modèl kòmanse nan Picker (PG = 10-12) pou ogmante nivo mikrokontwolè nan nivo mikrogram (μg = -6).Yon selil sib ka detekte nan 1 milyon selil;nan deteksyon an nan viris, sansiblite nan PCR ka rive nan 3 RFUs (tach vid ki fòme inite);to deteksyon minimòm nan syans bakteri se 3 bakteri.

● Senp ak vit

Refleksyon PCR la sèvi ak yon tanperati ki wo Taq DNA polymerase, ki ajoute solisyon reyaksyon an nan yon sèl fwa, se sa ki, yon reyaksyon degeneration-anneal-extension sou solisyon anplifikasyon ADN ak po beny dlo.Anjeneral, reyaksyon anplifikasyon an fini nan 2 a 4 èdtan.Ogmante pwodwi yo jeneralman analize pa epe elektrik, epi yo pa oblije sèvi ak izotòp, pa gen okenn polisyon radyo-aktif, ak pwomosyon fasil.

● Pite echantiyon an ba

Pa gen okenn nesesite separe viris oswa bakteri ak selil kilti.Pwodwi ADN brit ak RNA ka itilize kòm anplifikatè.Deteksyon anplifikasyon ADN ka itilize dirèkteman lè l sèvi avèk espesimèn klinik tankou san, likid kò, likid lave tous, cheve, selil, ak tisi vivan.

PCRpwoblèm komen

● Fo negatif, pa gen okenn bann anplifye

Etap kle yo nan reyaksyon PCR la gen ladan: ① preparasyon nan asid nikleyik modèl, ② kalite ak espesifik nan primè, ③ bon jan kalite a nan anzim ④ kondisyon sik PCR.Jwenn rezon ki fè yo ta dwe tou analize ak etidye pou lyen ki anwo yo.

Modèl: ① Modèl la gen divès kalite pwoteyin, ② Modèl la gen yon inibitè anzim Taq, ③ Pwoteyin nan modèl la pa elimine, espesyalman pwoteyin gwoup la nan kwomozòm lan.⑤ Deminer koripsyon asid nikleyik pa bon jan.Lè bon jan kalite a nan anzim ak primè yo bon, pa gen okenn gwoup anplifikasyon, ki gen plis chans tretman dijestif la nan espesimèn.Gen yon bagay ki mal ak pwosesis ekstraksyon asid nikleyik modèl la, kidonk pou prepare yon solisyon dijesyon efikas ak ki estab, pwosedi li yo ta dwe fiks epi yo pa chanje abitrèman.

Inaktivasyon anzim: yo ta dwe itilize yon nouvo anzim oswa tou de ansyen ak nouvo anzim ansanm pou analize si aktivite anzim la pèdi oswa ensifizan, ki mennen ale nan fo negatif.Li ta dwe remake ke anzim Taq oswa bromur etidyòm pafwa bliye.

Jadendanfan: bon jan kalite a nan Jadendanfan an, konsantrasyon a nan Jadendanfan an, epi si konsantrasyon nan de Jadendanfan yo se simetrik.Li se yon rezon komen pou echèk PCR la oswa gwoup la ogmante se pa ideyal ak tandans difize.Gen pwoblèm ak kalite primè yo nan kèk nimewo pakèt.De primè yo gen yon gwo konsantrasyon ak yon konsantrasyon ki ba, sa ki lakòz ba-efikasite asimetri anplifikasyon.Kont-mezi yo se: ① Chwazi yon bon primè pou fè sentèz inite yo.② Konsantrasyon Jadendanfan an pa sèlman depann de valè OD a, men tou, peye atansyon sou likid orijinal Jadendanfan an pou fè elektwoforèz jèl sik agar.Dwe gen yon zòn teren Jadendanfan, ak klète de Jadendanfan yo ta dwe jeneralman konsistan.Belt, PCR ka echwe nan moman sa a, epi li ta dwe rezoud ak inite a sentèz Jadendanfan.Si yon Jadendanfan wo, klète a ba, epi konsantrasyon li yo dwe balanse lè dilye.③ Jadendanfan an ta dwe peye epi estoke nan yon gwo konsantrasyon pou anpeche plizyè konjelasyon oswa pati frijidè alontèm nan frijidè a, ki pral lakòz Jadendanfan an deteryore ak degrade.④ Desen an nan Jadendanfan an pa rezonab, tankou longè Jadendanfan an se ensifizan, ak gwoup di a fòme ant Jadendanfan yo.

Mg2 + konsantrasyon: Mg2 + konsantrasyon ion gen yon gwo enpak sou efikasite anplifikasyon PCR.Twòp konsantrasyon ka diminye sèks opoze a nan anplifikasyon PCR.Si konsantrasyon an twò ba, pwodiksyon anplifikasyon PCR la pral menm fè echèk anplifikasyon PCR san gwoup ekspansyon an.

Chanjman nan volim reyaksyon: Volim yo itilize nan anplifikasyon PCR se 20ul, 30ul, ak 50ul oswa 100ul, se gwo volim aplikasyon an pou anplifikasyon PCR mete dapre diferan rezon rechèch syantifik ak tès klinik.Apre fè ti volim tankou 20ul, li nesesè fè yon kondisyon kòd lè w ap fè gwosè a, otreman li pral echwe.

Rezon fizik: Transfòmasyon trè enpòtan pou anplifikasyon PCR.Si tanperati koripsyon an ba, tan koripsyon an kout, li gen anpil chans rive nan fo negatif;twò ba tanperati rkwir ka lakòz anplifikasyon ki pa espesifik epi redwi efikasite anplifikasyon espesifik.Trè afekte konbinezon primè ak modèl pou diminye efikasite anplifikasyon PCR.Pafwa li nesesè yo sèvi ak tèmomèt estanda yo detekte varyasyon, rkwir ak pwolonje tanperati nan ekstansyon an oswa dlo-idrosolubl cuisinier, ki se youn nan rezon ki fè echèk la nan PCR la.

Variant sekans sib: Si sekans sib la rive, yon mitasyon oswa sipresyon, konbinezon pwototip la ak modèl la konbine, oswa akòz mank de sekans sib, primè a ak modèl la ap pèdi sekans konplemantè a, epi anplifikasyon PCR li yo pa pral reyisi.

● Fo pozitif

Bann anplifikasyon PCR la parèt ki konsistan avèk gwoup sekans sib la, epi pafwa gwoup li yo pi pwòp ak pi wo.

Jadendanfan konsepsyon pa apwopriye: sekans anplifikasyon chwazi a ak sekans anplifikasyon ki pa objektif gen omològ, kidonk lè anplifikasyon PCR, pwodwi PCR anplifye yo se sekans ki pa gen objektif.Sekans sib la twò kout oswa Jadendanfan an twò kout, epi li gen tandans bay fo pozitif.Bezwen reamenaje.

Polisyon kwa nan sekans sib oswa pwodwi anplifikasyon: Gen de rezon pou polisyon sa a: Premyèman, polisyon kwa nan genomic a tout antye oswa gwo segman, ki mennen nan fo pozitif.Kalite fo pozitif sa a ka rezoud pa metòd sa yo: Fè atansyon ak dou pandan operasyon an pou anpeche sekans sib la respire nan zam echantiyon an oswa Splash soti nan tib santrifujeur la.Eksepte pou anzim ak sibstans ki pa ka kenbe tèt ak tanperati ki wo, tout reyaktif oswa ekipman yo ta dwe dezenfekte ak presyon ki wo.Tiyo santrifujeur yo ak echantiyon yo ta dwe itilize nan yon sèl fwa.Lè sa nesesè, anvan ou ajoute espesimèn, tib reyaksyon ak reyaktif yo ekspoze a reyon iltravyolèt pou detwi asid nikleyik ki egziste deja.Dezyèmman, ti fragman nan polisyon lè a.Ti fragman sa yo pi kout pase sekans sib la, men yo gen sèten omoloji.Li ka spliced ​​youn ak lòt.Apre konplete primè yo, pwodwi PCR la ka elaji, ki pral lakòz fo pwodiksyon pozitif.Li ka itilize pou diminye oswa elimine metòd PCR nich la.

● Parèt bann anplifikasyon ki pa espesifik

Bann ki te parèt apre anplifikasyon PCR yo pa konsistan avèk gwosè yo te espere, oswa gwo oswa piti, oswa an menm tan, oswa an menm tan, bann anplifikasyon espesifik ak bann anplifikasyon ki pa espesifik.Aparisyon nan bann ki pa espesifik se: Premyèman, primè yo enkonplè konplemantè a sekans sib la, oswa polymerization nan Jadendanfan an fòme yon grap di.Dezyèm lan se ke konsantrasyon nan MG2 + iyon twò wo, tanperati a annealing twò ba, ak kantite sik PCR ki gen rapò.Dezyèmman, bon jan kalite a ak kantite anzim yo.Souvan, enzymes de kèk sous yo gen tandans pou bann ki pa espesyal Et enzymes de lòt sous yo pa fèt.Pafwa anplifikasyon ki pa espesifik nan anzim rive tou.Kontre mezi yo se: re-desine atire si sa nesesè.Diminye kantite anzim oswa ranplase anzim yon lòt sous.Diminye kantite primè, ogmante kantite modèl kòmsadwa, epi redwi kantite sik.Byen ogmante tanperati a annealing oswa itilize metòd la de pwen tanperati (93 ° C koripsyon, annealing ak pwolonje nan apeprè 65 ° C).

● Parèt kasèt kasèt oswa kasèt

Anplifikasyon PCR pafwa parèt yo dwe aplike oswa kale oswa senti tapi ki tankou.Pou rezon an, akòz kantite twòp nan anzim oswa bon jan kalite pòv nan anzim la, konsantrasyon dNTP a twò wo, konsantrasyon Mg2 + a twò wo, tanperati a annealing twò ba, ak kantite sik twòp.Kontre mezi yo se: ①Diminye kantite anzim, oswa chanje anzim nan yon lòt sous.②Redwi konsantrasyon dNTP ③Byen redui konsantrasyon Mg2+.④Ogmante kantite modèl epi redwi kantite sik.

Pwodwi ki gen rapò

PCR Heroᵀᴹ (Avèk lank)

◮ Pi wo fidelite: 6 fwa sa a nan anzim Taq òdinè;

◮ Vitès anplifikasyon pi vit

◮ Plis adaptabilite modèl

◮ Pi wo efikasite anplifikasyon

◮ Tolerans anviwònman an pi fò: mete nan 37 ° C pou yon semèn, kenbe plis pase 90% aktivite;

◮ Li gen aktivite 5'→3' ADN polymerase ak 5'→3' aktivite eksonukleaz, san aktivite 3'→5' exonukleaz.

PCR Easyᵀᴹ (Avèk lank)

Sistèm reyaksyon inik ak segondè-efikasite Taq DNA Polymerase fè reyaksyon PCR la gen pi wo efikasite anplifikasyon, espesifik ak sansiblite.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (One Step)-SYBR Green I

◮ Twous yon sèl etap fè transkripsyon ranvèse ak qPCR de reyaksyon nan menm tib la, sèlman bezwen ajoute modèl RNA, premye PCR espesifik ak RNase-Free ddH.₂O.

◮ Twous la ka byen vit ak efikasite analize quantitatively RNA viral oswa tras RNA.

◮ Twous la sèvi ak yon reyaktif transkripsyon ranvèse Foregene inik ak Foregene HotStar Taq DNA Polymerase konbine avèk yon sistèm reyaksyon inik pou efektivman amelyore efikasite anplifikasyon ak espesifik reyaksyon an.

◮ Sistèm reyaksyon optimize a fè reyaksyon an gen pi wo sansiblite deteksyon, pi fò estabilite tèmik, ak pi bon tolerans.

◮ RT-qPCR fasil^TM(One Step)-SYBR Green I twous vini ak ROX entèn lank referans, ki ka itilize pou elimine siyal background ak erè siyal ant pwi, ki se pratik pou kliyan yo itilize nan diferan modèl nan enstriman PCR quantitative.

RT fasil^TMII (Mèt Premix pou premye-seksyon cDNA sentèz pouPCR an tan reyèl)

-Efikas kapasite pou retire gDNA, ki ka retire gDNA nan modèl la nan 2 minit.

-Efikas ranvèse transcription sistèm, li sèlman pran 15 minit pou konplete sentèz premye strand cDNA a.

-Modèl konplèks: modèl ki gen gwo kontni GC ak estrikti segondè konplèks kapab tou ranvèse ak efikasite segondè.

-Segondè sansiblite ranvèse transcription sistèm, pg-nivo modèles kapab tou jwenn bon kalite cDNA.

-Sistèm transkripsyon ranvèse a gen gwo estabilite tèmik, tanperati reyaksyon optimal se 42 ℃, epi li toujou gen bon pèfòmans transkripsyon ranvèse nan 50 ℃.