PCR (reyaksyon chèn polymerase) se youn nan teknoloji anplifikasyon ADN in vitro, ak yon istwa ki gen plis pase 30 ane.

Teknoloji PCR te pyonye pa Kary Mullis nan Cetus, USA an 1983. Mullis te aplike pou yon patant PCR an 1985 epi li te pibliye premye papye akademik PCR sou Syans nan menm ane a.Mullis te bay Pri Nobèl nan Chimi an 1993 pou travay li.

Prensip debaz PCR

PCR ka anplifye fragman ADN sib pa plis pase yon milyon fwa.Prensip la se anba kataliz ADN polymerase, lè l sèvi avèk paran strand ADN kòm yon modèl ak Jadendanfan espesifik kòm pwen depa pou ekstansyon.Li se repwodui nan vitro atravè etap tankou denaturasyon, annealing, ak ekstansyon.Pwosesis ADN pitit fi a konplemantè ak ADN modèl paran an.

Pwosesis PCR estanda a divize an twa etap:

1.Denaturation: Sèvi ak tanperati ki wo pou separe fil doub ADN.Kosyon idwojèn ant fil doub ADN kase nan tanperati ki wo (93-98 ℃).

2.Annealing: Apre yo fin separe ADN doub-bloke a, bese tanperati a pou Jadendanfan an ka mare ak ADN sèl-bloke la.

3.Extension: ADN polymerase a kòmanse fè sentèz seksyon konplemantè sou fil ADN ki soti nan primè yo mare lè tanperati a bese.Lè ekstansyon an fini, yon sik fini, ak kantite fragman ADN double

Resipwòk twa etap sa yo 25-35 fwa, kantite fragman ADN ap ogmante eksponansyèlman.

Enjenyeu PCR la se ke diferan primè yo ka fèt pou diferan jèn sib, se konsa ke fragman jèn sib yo ka anplifye nan yon kout peryòd de tan.

Jiskaprezan, PCR ka divize an twa kategori, sètadi PCR òdinè, PCR quantitative fluorescent ak PCR dijital.

Premye jenerasyon PCR òdinè

Sèvi ak yon enstriman anplifikasyon PCR òdinè pou anplifye jèn sib la, epi sèvi ak elektwoforèz jèl agarose pou detekte pwodwi a, se sèlman analiz kalitatif yo ka fè.

Dezavantaj prensipal yo nan premye jenerasyon PCR la:

1.Prone pou anplifikasyon ki pa espesifik ak fo rezilta pozitif.

2.Deteksyon an pran yon bon bout tan ak operasyon an ankonbran.

3.Only tès kalitatif ka fè

Dezyèm jenerasyon an tan reyèl PCR

PCR an tan reyèl, ke yo rele tou qPCR, sèvi ak sond fliyoresan ki ka endike pwogrè sistèm reyaksyon an, epi kontwole akimilasyon pwodwi anplifye atravè akimilasyon siyal fliyoresan, epi jije rezilta yo atravè koub fliyoresan an.Li ka quantifye avèk èd nan valè Cq ak koub estanda.

Paske teknoloji qPCR la te pote soti nan yon sistèm fèmen, pwobabilite pou kontaminasyon redwi, epi siyal fluoresans la ka kontwole pou deteksyon quantitative, kidonk li se pi lajman itilize nan pratik klinik e li te vin teknoloji dominan nan PCR.

Sibstans fliyoresan yo itilize nan PCR quantitative fluoresan an tan reyèl yo ka divize an: TaqMan fliyoresan pwofonde, molekilè beacons ak lank fliyoresan.

1) Sond fliyoresan TaqMan:

Pandan anplifikasyon PCR, yo ajoute yon pwofonde fliyoresan espesifik pandan y ap ajoute yon pè Jadendanfan.Sond la se yon oligonukleotid, ak tou de bout yo make ak yon gwoup fliyoresan repòtè ak yon gwoup fliyoresan quencher.

Lè sond la entak, siyal fliyoresan ki emèt pa gwoup repòtè a absòbe gwoup trempe a;pandan anplifikasyon PCR, aktivite eksonukleaz 5′-3′ nan anzim Taq fende ak degrade pwofonde a, fè gwoup fliyoresan repòtè a ak quencher gwoup fliyoresan separe, pou sistèm siveyans fliyoresan an ka resevwa siyal fliyoresan, se sa ki, chak fwa yon fil ADN anplifye, se yon siyal fluorescent akimile fòmasyon fliyoresan. pwodwi PCR la.

2) lank fluorescent SYBR:

Nan sistèm reyaksyon PCR la, yo ajoute yon eksè koloran fliyoresan SYBR.Apre lank fliyoresan SYBR la ki pa espesifikman enkòpore nan doub-strand ADN, li emèt yon siyal fliyoresan.Molekil lank SYBR ki pa enkòpore nan chèn lan pa pral emèt okenn siyal fliyoresan, kidonk asire siyal fliyoresan Ogmantasyon nan pwodwi PCR yo konplètman senkronize ak ogmantasyon nan pwodwi PCR.SYBR sèlman mare ak ADN doub, kidonk koub k ap fonn lan ka itilize pou detèmine si reyaksyon PCR la espesifik.

3) Beacon molekilè:

Li se yon tij-bouk doub-etikèt sond oligonukleotid ki fòme yon estrikti epengl nan apeprè 8 baz nan 5 ak 3 bout yo.Sekans asid nikleyik nan tou de bout yo konplemantèman pè, sa ki lakòz gwoup la fliyoresan ak gwoup la trempe yo dwe sere.Fèmen, pa gen okenn fluoresans yo pral pwodwi.

Apre yo fin pwodwi PCR pwodwi a, pandan pwosesis la annealing, se pati mitan an nan molekilè Beacon la pè ak yon sekans ADN espesifik, ak jèn fliyoresan an separe de jèn nan quencher pou pwodwi fluoresans.

Dezavantaj prensipal yo nan dezyèm jenerasyon PCR:

Sansiblite toujou manke, ak deteksyon an nan espesimèn ki ba-kopi pa kòrèk.

Gen enfliyans nan valè background nan, ak rezilta a se sansib a entèferans.

Lè gen inibitè PCR nan sistèm reyaksyon an, rezilta deteksyon yo sansib a entèferans.

Twazyèm jenerasyon PCR dijital

Digital PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) kalkile nimewo kopi sekans sib la atravè deteksyon pwen final, epi li ka fè deteksyon egzat quantitative absoli san yo pa itilize kontwòl entèn ak koub estanda.

PCR dijital sèvi ak deteksyon pwen final la epi li pa depann de valè Ct (papòt sik), kidonk reyaksyon PCR dijital la mwens afekte pa efikasite anplifikasyon, epi tolerans pou inibitè reyaksyon PCR amelyore, ak presizyon segondè ak repwodiksyon.

Akòz karakteristik sa yo nan sansiblite segondè ak presizyon segondè, li pa fasil entèfere pa inhibiteur reyaksyon PCR, epi li ka reyalize vre quantifikasyon absoli san pwodwi estanda, ki te vin tounen yon rechèch ak aplikasyon otspo.

Dapre diferan fòm inite reyaksyon an, li ka divize an twa kalite prensipal: mikrofluidik, chip ak sistèm gout.

1) PCR dijital mikrofluidik, mdPCR:

Baze sou teknoloji mikrofluidik la, modèl ADN separe.Teknoloji mikrofluidik la ka reyalize echantiyon nano-amelyorasyon oswa jenerasyon ti gout ki pi piti, men ti gout yo bezwen yon metòd adsorption espesyal ak Lè sa a, konbine avèk sistèm reyaksyon PCR la.mdPCR piti piti te adopte pa lòt metòd ranplase.

2) PCR dijital ki baze sou goutlet, ddPCR:

Sèvi ak teknoloji jenerasyon ti gout dlo-an-lwil pou trete echantiyon an nan ti gout, epi divize sistèm reyaksyon an ki gen molekil asid nikleyik an dè milye de ti gout nanokal, chak nan yo pa genyen molekil sib asid nikleyik yo dwe detekte, oswa Gen youn a plizyè molekil sib asid nikleyik yo dwe teste.

3) PCR dijital ki baze sou chip, cdPCR:

Sèvi ak teknoloji chemen an likid entegre pou grave anpil mikrotub ak mikrokavite sou silisyòm wafers oswa vè kwats, epi kontwole koule nan solisyon an atravè tiyo kontwòl diferan, epi divize likid echantiyon an nan nanomèt menm gwosè a nan pwi reyaksyon yo pou reyaksyon PCR dijital pou reyalize quantification absoli.

Dezavantaj prensipal yo nan twazyèm jenerasyon PCR la:

Ekipman ak reyaktif yo chè.

Kondisyon kalite modèl yo wo anpil.Si kantite modèl la depase kantite mikwosistèm, li pral enposib pou kantite, epi si li twò piti, presizyon nan quantifikasyon ap redwi.

Fo pozitiv yo ka pwodwi tou lè gen anplifikasyon ki pa espesifik.