COVID-19 se yon maladi enfektye ki koze pa Sendwòm Respiratwa Aigu Grav Coronavirus Tip 2. Lè yon moun enfekte, sentòm ki pi komen yo enkli lafyèv, tous, ak souf kout.

Echantiyon yo itilize pou tès yo ka kolekte pa prelèvman nasopharyngeal oswa prelèvman oropharyngeal.

ki sa ki PCR?

Metòd estanda pou deteksyon kowonaviris la se reyaksyon chèn polymerase, PCR.Sa a se yon metòd lajman ki itilize nan byoloji molekilè.Li ka byen vit kopye dè milyon pou plizyè milya fragman ADN espesifik.

Nouvo kowonaviris la gen yon jenom RNA ki gen yon sèl chenn trè long.Yo nan lòd yo detekte viris sa yo pa PCR, molekil RNA yo dwe konvèti nan sekans ADN konplemantè yo pa transkriptaz ranvèse, ak Lè sa a, ADN ki fèk sentèz la ka anplifye pa pwosedi PCR estanda, ki se souvan ke yo rekonèt kòm RT-PCR.

Pwosesis RT-PCR

RNA ekstraksyon

Pou fè metòd sa a, RNA viral yo ta dwe fondamantalman ekstrè.Yon varyete twous pou pirifye RNA ka itilize pou separasyon pratik, rapid ak efikas.

Pou ekstrè RNA viral lè l sèvi avèk yon twous komèsyal, premye ajoute echantiyon an nan yon tib mikrosantrifij epi melanje l ak tanpon liz la.Tanpon sa a trè denatire epi anjeneral konsiste de fenol ak guanidine isothiocyanate.Anplis de sa, inhibiteurs RNase yo anjeneral prezan nan tanpon liz la pou asire izolasyon RNA viral entak.

Apre ajoute tanpon lysis la, toubiyon tib melanje a pa batman kè epi enkube nan tanperati chanm.Lè sa a, viris la lysed anba kondisyon trè denaturasyon bay tanpon liz la.

Apre echantiyon an lysed, yo itilize yon tib santrifij pou pwosedi pou pirifye a.Echantiyon an chaje nan tib santrifij la epi answit santrifuje.

Pwosedi sa a se yon metòd ekstraksyon faz solid kote faz estasyonè a konsiste de yon matris jèl silica.

Nan kondisyon optimal sèl ak pH, molekil RNA mare nan manbràn silica a.

An menm tan an, yo retire pwoteyin ak lòt kontaminan.

Apre santrifijasyon, mete tib santrifij la nan yon tib koleksyon pwòp, jete filtraj la, epi ajoute tanpon lave.

Mete tib la nan santrifijeur a ankò pou fòse tanpon lave a nan manbràn an.Sa a pral retire tout enpurte ki rete nan manbràn nan, kite sèlman RNA a mare nan jèl la silica.

Apre yo fin lave echantiyon an, mete tib la nan yon tib mikrosantrifij pwòp epi ajoute tanpon elisyon an.

Lè sa a, li santrifuje fòse tanpon elisyon an nan manbràn an.Tanpon elisyon an retire RNA viral nan kolòn vire epi li jwenn RNA pirifye san pwoteyin, inibitè, ak lòt kontaminan.

ETAP 2

Konsantre melanje

Apre ekstrè RNA viral la, pwochen etap la se prepare melanj reyaksyon an pou anplifikasyon PCR.Nan etap sa a, yo itilize konsantre.Solisyon konsantre sa a se yon solisyon konsantre premiz ki gen ladann yon premiz, transkriptaz ranvèse, nukleotid, primè pou pi devan, primè ranvèse, sond TaqMan ak ADN polymerase.

Finalman, pou konplete melanj reyaksyon sa a, yo ajoute modèl RNA a.Tib yo melanje pa vortexing batman kè, ak Lè sa a, melanj reyaksyon an chaje nan plak PCR la.Plak PCR a anjeneral gen 96 pwi epi li ka analize plizyè echantiyon an menm tan.

ETAP 3

PCR anplifikasyon

Apre sa, mete plak la nan machin PCR la, ki se esansyèlman yon cycler tèmik.

Yo itilize RT-PCR an tan reyèl pou detekte nouvo coronavirus 2019 la lè yo anplifye sekans sib la nan jèn RdrRP, jèn E ak jèn N.Chwa jèn sib la depann de sekans Jadendanfan ak pwofonde.

Premye etap la nan RT-PCR se transkripsyon ranvèse.Se premye fil ADN konplemantè sentèz, ki inisye pa Jadendanfan ranvèse PCR la, ki mare ak pati konplemantè genòm RNA viral la.Lè sa a, transkriptaz ranvèse ajoute nukleotid ADN nan fen 3' nan Jadendanfan an pou fè sentèz ADN konplemantè ak RNA viral la.Tanperati a ak dire etap sa a depann de primè yo, RNA sib, ak transkriptaz ranvèse yo itilize.

Apre sa, yon premye etap denaturasyon aplike, ki lakòz denaturasyon ibrid RNA-ADN la.Etap sa a nesesè pou aktive ADN polymerase la.An menm tan an, transkriptaz ranvèse inaktive.

PCR konsiste de yon seri sik tèmik.Chak sik konsiste de etap denaturasyon, rkwir ak ekstansyon.

Etap denaturasyon an enplike chofe chanm reyaksyon an a 95 degre Sèlsiyis epi sèvi ak li pou denaturasyon modèl ADN doub-cheche a.

Nan pwochen etap la, tanperati reyaksyon an redwi a 58 degre Sèlsiyis, sa ki pèmèt Jadendanfan pi devan an rkwit nan pati konplemantè nan modèl ADN sèl-bloke li yo.Tanperati a annealing dirèkteman depann sou longè ak konpozisyon Jadendanfan an.

Nan etap ekstansyon an, ADN polymerase sentèz yon nouvo seksyon ADN ki konplemantè ak seksyon modèl ADN.Lè w ajoute nwayo gratis konplemantè ak modèl la nan direksyon 5'a 3' nan melanj reyaksyon an.Tanperati etap sa a depann de ADN polymerase yo itilize a.

Apre premye sik la, yo jwenn yon sib ADN doub-cheche.

Lè sa a, antre nan dezyèm sik la.ADN doub-chache a denatire pou pwodui de molekil ADN sèl-chachen.

Nan pwochen etap la, tanperati reyaksyon an bese, primè yo rkwit nan chak modèl ADN sèl-bloke, epi pwofonde Taq-man an rkwit nan pati konplemantè ADN sib la.

Sond TaqMan la konsiste de yon fliyofò kovalan lye ak 5'fen ankèt oligonukleotid la.Lè sous limyè sikilasyon an eksite, fliyofò a emèt fliyoresans.Anplis de sa, ankèt la konpoze de yon quencher nan 3′fen an.Pwoksimite jèn repòtè a ak quencher la anpeche deteksyon fliyoresans.

Nan etap ekstansyon an, ADN polymerase sentèz yon nouvo fil.Lè polymerase a rive nan pwofonde TaqMan, aktivite andojèn 5'nukleaz li yo cleaves sond la, separe lank la ak quencher la.

Avèk chak sik PCR, plis molekil lank yo lage, sa ki lakòz yon ogmantasyon nan entansite fliyoresans pwopòsyonèl ak kantite anplikon sentèz.

Metòd sa a pèmèt yo estime kantite yon sekans bay prezan nan echantiyon an.Kantite fragman ADN doub-cheche double nan chak sik.Se poutèt sa, PCR ka itilize pou analize echantiyon piti anpil.

Pou mezire siyal fliyoresan, lanp alojene tengstèn, filtre eksitasyon, reflektè, lantiy, filtre emisyon ak chaj makonnen aparèy-itilize kamera CCD.

ETAP 4 Detekte

Pou mezire siyal fliyoresan, lanp alojene tengstèn, filtre eksitasyon, reflektè, lantiy, filtre emisyon ak chaj makonnen aparèy-itilize kamera CCD.

Limyè filtre ki soti nan lanp lan reflete pa reflektè a, pase nan lantiy kondansasyon an, epi li konsantre sou sant chak twou.Lè sa a, fliyoresans ki emèt nan twou a reflete nan glas la, pase nan filtè emisyon an, epi li detekte pa kamera ks la.Nan chak sik PCR, limyè fluorophore eksite pwòp tèt ou ka detekte pa CCD la.

Li konvèti limyè a kaptire nan done dijital.Metòd sa a rele an tan reyèl PCR, epi li pèmèt siveyans an tan reyèl nan pwogrè nan reyaksyon PCR la.