Kòm yon nouvo nan laboratwa a, li pa yon bon travay pou depistaj plant pozitif nan yon pakèt plant ak yon pousantaj konvèsyon ki ba.Premyèman, ADN dwe ekstrè soti nan yon gwo kantite echantiyon youn pa youn, ak Lè sa a, jèn etranje yo pral detekte pa PCR.Sepandan, rezilta yo souvan vid ak bann ak kèk atik detanzantan, men li enposib detèmine si gen deteksyon rate oswa deteksyon fo..Èske li trè dekouraje fè fas ak pwosesis eksperimantal sa yo ak rezilta yo?Pa enkyete w, frè a anseye w kijan pou w detekte plant transjenik pozitif fasil epi avèk presizyon.

Etap 1

Desine deteksyon primè

Detèmine jèn andojèn ak jèn eksojèn yo dwe detekte dapre echantiyon yo dwe teste a, epi chwazi yon sekans reprezantan 100-500bp nan jèn nan pou konsepsyon primè.Bon primè ka asire presizyon nan rezilta deteksyon yo ak diminye tan deteksyon an (gade apendis la pou primè deteksyon souvan itilize).

Avi: Jadendanfan ki fèk fèt yo bezwen optimize kondisyon reyaksyon yo epi verifye presizyon, presizyon ak limit deteksyon deteksyon an anvan deteksyon gwo echèl la.

Etap 2

Konsepsyon pwotokòl eksperimantal

Kontwòl pozitif: Sèvi ak ADN pirifye ki gen fragman sib la kòm yon modèl pou detèmine si sistèm reyaksyon PCR ak kondisyon yo nòmal.

Kontwòl negatif/vid: Sèvi ak modèl ADN oswa ddH2O ki pa genyen fragman sib la kòm modèl pou detekte si gen yon sous kontaminasyon nan sistèm PCR la.

Kontwòl referans entèn: sèvi ak konbinezon primè/sond nan jèn andojèn echantiyon an pou teste pou evalye si PCR ka detekte modèl la.

Avi:

Kontwòl pozitif, negatif/vid ak kontwòl entèn yo ta dwe mete pou chak tès pou evalye validite rezilta eksperimantal yo.

Preparasyon eksperyans

Anvan w itilize, obsève si solisyon an melanje byen.Si yo jwenn presipitasyon, li bezwen fonn ak melanje dapre enstriksyon yo anvan ou itilize.2 × PCR melanj bezwen yo dwe pipette ak melanje repete ak yon mikropipèt anvan ou itilize pou evite distribisyon iyon inegal.

Avi:

Pran manyèl la epi li ak anpil atansyon, epi fè preparasyon anvan eksperyans la an akò strik ak egzijans manyèl la.

Etap 4

Prepare sistèm reyaksyon PCR

Dapre pwotokòl eksperimantal la, melanje primè yo, H2O, ak 2 × PCR melanje respire, santrifuje epi distribye yo nan chak tib reyaksyon.

Avi:

Pou tès gwo echèl oswa alontèm, li rekòmande pou sèvi ak yon sistèm reyaksyon PCR ki gen anzim UNG, ki ka efektivman evite kontaminasyon aerosol ki te koze pa pwodwi PCR.

Etap 5

Ajoute modèl reyaksyon

Sèvi ak Direct PCR teknoloji, pa gen okenn nesesite pou pwosesis pirifikasyon asid nikleyè fatigan, modèl echantiyon an ka prepare nan lespas 10 minit, epi yo ka ajoute sistèm reyaksyon PCR ki koresponn lan.

Avi:

Metòd klivaj la gen pi bon efè deteksyon, epi pwodwi a jwenn yo ka itilize pou reyaksyon deteksyon miltip.

5.1: Ekspansyon dirèk nan fèy yo

Dapre gwosè foto a nan manyèl la, koupe tisi fèy la ak yon dyamèt 2-3mm epi mete l nan sistèm reyaksyon PCR la.

Remak: Asire w ke fragman fèy yo konplètman benyen nan solisyon reyaksyon PCR la, epi pa ajoute tisi fèy twòp.

5.2: Metòd fann fèy

Koupe tisi fèy la ak yon dyamèt 5-7mm epi mete l nan yon tib santrifujeur.Si w chwazi fèy ki gen matirite, tanpri evite itilize tisi yo nan venn prensipal fèy la.Pipèt 50ul Buffer P1 lysate nan yon tib santrifujeur asire ke lysate la ka konplètman plonje tisi fèy la, mete l nan yon sikilasyon tèmik oswa yon beny metal, ak lyse nan 95 ° C pou 5-10 minit.

Ajoute 50ul tanpon P2 netralizasyon solisyon ak melanje byen.Lysate ki kapab lakòz yo ka itilize kòm yon modèl epi ajoute nan sistèm reyaksyon PCR la.

Remak: Kantite modèl la se ant 5-10% nan sistèm PCR la, epi li pa ta dwe depase 20% (pa egzanp, nan yon sistèm PCR 20μl, ajoute 1-2μl nan solisyon lysis, pa plis pase 4μl).

Etap 6

Reyaksyon PCR

Apre santrifuje tib reyaksyon PCR la, li mete l nan yon enstriman PCR pou anplifikasyon.

Avi:

Reyaksyon an sèvi ak modèl ki pa pirifye pou anplifikasyon, kidonk kantite sik anplifikasyon se 5-10 plis sik pase lè w ap itilize modèl ADN pirifye.

Etap 7

Deteksyon elektwoforèz ak analiz rezilta

M: Nechèl ADN 100bp

1\4: metòd ADN pirifye

2\5: Metòd PCR dirèk

3\6: Kontwòl vid

QC:

Rezilta tès yo nan divès kalite kontwòl mete nan eksperyans la ta dwe satisfè kondisyon sa yo.Sinon, yo ta dwe analize kòz pwoblèm nan, epi yo ta dwe fè tès la ankò apre yo fin elimine pwoblèm nan.

Tablo 1. Rezilta tès nòmal divès gwoup kontwòl

*Lè plasmid la itilize kòm yon kontwòl pozitif, rezilta tès jèn andojèn yo ka negatif

Jijman rezilta:

A. Rezilta tès la nan jèn andojèn nan echantiyon an se negatif, ki endike ke ADN a apwopriye pou deteksyon PCR òdinè pa ka ekstrè nan echantiyon an oswa ADN nan ekstrè gen inibitè reyaksyon PCR, ak ADN a ta dwe ekstrè ankò.

B. Rezilta tès la nan jèn andojèn nan echantiyon an se pozitif, ak rezilta tès la nan jèn nan ekzojèn se negatif, ki endike ke ADN apwopriye pou deteksyon PCR òdinè ekstrè soti nan echantiyon an, epi li ka jije ke jèn nan XXX pa detekte nan echantiyon an.

C. Rezilta tès la nan jèn andojèn nan echantiyon an se pozitif, ak rezilta tès la nan jèn nan ekzojèn se pozitif, ki endike ke ADN apwopriye pou deteksyon PCR òdinè yo te ekstrè soti nan echantiyon an, ak ADN echantiyon an gen jèn nan XXX.Eksperyans konfimasyon ka pi lwen te pote soti.

Etap 8

Desine deteksyon primè

Apre eksperyans lan, sèvi ak 2% solisyon ipoklorit sodyòm ak 70% solisyon etanòl pou siye zòn eksperimantal la pou anpeche polisyon nan anviwònman an.