Ⅰ. Ogmante sansiblite sistèm reyaksyon an:

1. Separe RNA kalite siperyè:

Siksè sentèz cDNA soti nan bon jan kalite RNA.RNA-wo kalite ta dwe asire omwen yon total pi long epi li pa gen inibitè ki pa gen anzim anrejistreman, tankou EDTA oswa SDS.Kalite RNA detèmine valè maksimòm enfòmasyon sekans ou ka transkri nan cDNA a.Metòd jeneral RNA pou pirifye se yon metòd etap pou itilize isocyanate/acidophenol.Yo nan lòd yo anpeche polisyon nan RNase, RNA a separe de yon echantiyon ki rich nan RNase (tankou pankreyas) mande pou depo fòmaldeyid pou konsève pou RNA bon jan kalite, ki se menm plis konsa pou depo alontèm.RNA extrait nan fwa rat la te fondamantalman dégradé apwè yon semèn depo nan dlo, pandan ke RNA extrait de rat larat rete stab apre twa ane depo nan dlo.Anplis de sa, transkripsyon ki pi gwo pase 4kb yo pi sansib a degradasyon tras RNase pase ti transkripsyon.Yo nan lòd yo ogmante estabilite nan echantiyon RNA depo a, RNA a ka fonn nan yon methalmamine nan ion, epi li estoke -70 °C.Thylide yo itilize pou konsève pou RNA pa dwe genyen yon objè divès ki degrade RNA.RNA, ki sòti nan pankreyas, ka sove nan methalmamine pou omwen yon ane.Lè w pare pou itilize RNA, ou ka itilize metòd sa yo pou presipite RNA: ajoute NaCl a 0.2m ak 4 fwa volim etanòl, mete tanperati chanm nan pou 3-5 minit, ak 10,000 × g santrifujeur pou 5 minit.

2. Sèvi ak transkriptaz ranvèse san aktivite RNaseH (RNaseH-):

Inibitè RNase yo souvan ajoute nan reyaksyon transkripsyon ranvèse ogmante longè ak sede nan sentèz cDNA.Inibitè RNase yo ajoute nan premye reyaksyon sentèz chèn nan prezans tanpon ak ajan rediksyon tankou DTT paske pwosesis sentèz pre-cDNA la denatire inibitè a, kidonk lage RNases mare ki degrade RNA.Pwoteyin RNase inhibitor sèlman anpeche degradasyon RNA pa RNase A, B, C, epi yo pa anpeche RNases sou po a, kidonk yo ta dwe pran prekosyon pou pa prezante RNases nan dwèt yo malgre itilizasyon inhibiteurs sa yo.

Transkriptaz ranvèse katalize konvèsyon RNA nan cDNA.Tou de M-MLV ak AMV gen aktivite andojèn RNaseH anplis aktivite pwòp polymerase yo.Aktivite RNaseH fè konpetisyon ak aktivite polymerase pou seksyon etewozigòt ki fòme ant modèl RNA ak primè ADN oswa seksyon ekstansyon cDNA, epi li degrade RNA: seksyon RNA nan konplèks ADN.Modèl RNA degrade pa aktivite RNaseH pa ka itilize ankò kòm substrats efikas pou sentèz cDNA, diminye sede a ak longè sentèz cDNA.Se konsa, elimine oswa redwi anpil aktivite RNaseH nan transkriptaz ranvèse ta gen gwo benefis.

Transcriptaz ranvèse SuperScriptⅡ, transkriptaz ranvèse MMLV nan RNaseH- ak transkriptaz inverse thermoScript, AMV nan RNaseH- te bay plis cDNA plen longè pase MMLV ak AMV.Sansiblite RT-PCR afekte pa kantite cDNA sentèz.ThermoScript pi sansib pase AMV.Gwosè pwodwi RT-PCR limite pa kapasite transkriptaz ranvèse pou fè sentèz cDNA, espesyalman lè klonaj Cdna pi gwo.Konpare ak MMLV, SuperScripⅡ siyifikativman ogmante sede a nan pwodwi long RT-PCR.Transkriptaz ranvèse RNaseH- a tou ogmante estabilite tèmik, kidonk reyaksyon an ka fèt nan tanperati ki pi wo pase nòmal nan 37-42 ℃.Anba kondisyon yo sentèz sijere, oligo (dT) primè ak 10μCi [alpha-p] dCTP yo te itilize.Pwodiksyon total premye chèn lan te kalkile ak metòd presipitasyon TCA.Tout longè cDNA yo te analize lè l sèvi avèk retire retire teren gwosè-triye ak konte nan yon jèl agarose alkalin.

3. Ogmante tanperati prezèvasyon chalè nan transcription ranvèse:

Pi wo tanperati kenbe ede louvri estrikti segondè nan RNA ak ogmante sede a nan reyaksyon an.Pou pifò modèl RNA, kenbe RNA ak primè a 65 °C san tanpon oswa sèl epi answit refwadi yo byen vit sou glas elimine pifò estrikti segondè yo epi pèmèt primè yo mare.Sepandan, kèk modèl toujou gen estrikti segondè, menm apre denaturasyon tèmik.Anplifikasyon modèl difisil sa yo ka fèt lè l sèvi avèk ThermoScript ranvèse transkriptaz epi lè w mete reyaksyon transkriptaz ranvèse a nan pi wo tanperati pou amelyore anplifikasyon.Tanperati kenbe pi wo yo ka ogmante spesifik tou, sitou lè sentèz cDNA fèt lè l sèvi avèk GSPS (gene-specific primers) (gade chapit 3).Si w ap itilize GSP, asire w ke valè Tm nan jadendanfan an se menm jan ak tanperati kenbe espere a.Pa sèvi ak oligo (dT) ak primè o aza pi wo a 60 ℃.Primè o aza yo dwe kenbe nan 25 ℃ pou 10 minit anvan yo ogmante a 60 ℃.Anplis de itilize tanperati ranvèse transkripsyon ki pi wo, espesifikasyon ka amelyore lè w transfere dirèkteman melanj RNA/Jadendanfan soti nan tanperati denaturasyon 65 ℃ nan tanperati kenbe transcription ranvèse a epi ajoute yon melanj reyaksyon 2× prechofe (sentèz inisyasyon tèmik cDNA).Apwòch sa a ede anpeche pè a baz entèmolekilè ki rive nan pi ba tanperati.Sèvi ak yon enstriman PCR senplifye anpil switch tanperati ki nesesè pou RT-PCR.

Tth chalè estabilize polymerase aji kòm ADN polymerase nan prezans Mg2 + ak RNA polymerase nan prezans Mn2 +.Li ka kenbe chalè jiska 65 ℃.Sepandan, prezans Mn2 + pandan PCR diminye fidelite, sa ki fè Tth polymerase mwens apwopriye pou anplifikasyon segondè presizyon, tankou klonaj cDNA.Anplis de sa, Tth se mwens efikas nan transcription ranvèse, ki diminye sansiblite, e depi yon sèl anzim ka fè transcription ranvèse ak PCR, reyaksyon kontwòl san transcription ranvèse pa ka itilize yo fè distenksyon ant pwodwi anplifye nan cDNA ak sa yo ki kontamine ADN jenomik.

4. Aditif ki ankouraje transcription ranvèse:

Anplis de sa nan aditif, ki gen ladan gliserin ak DMSO, nan reyaksyon an premye sentèz chèn ka diminye estabilite nan asid nukleik doub strand la ak detant estrikti segondè RNA a.Jiska 20% gliserin oswa 10% DMSO ka ajoute san yo pa afekte aktivite SuperScriptⅡ oswa MMLV.AMV ka tolere tou jiska 20% gliserin san yo pa diminye aktivite.Pou maksimize sansiblite RT-PCR nan reyaksyon transkripsyon ranvèse SuperScriptⅡ, yo ka ajoute 10% gliserin epi izole nan 45℃.Si yo ajoute 1/10 nan pwodwi retrotranscription-reaksyon an nan PCR la, konsantrasyon nan gliserin nan reyaksyon anplifikasyon an se 0.4%, ki pa ase pou anpeche PCR.

5. RNaseH pwosesis:

Ou ka amelyore sansiblite lè w trete reyaksyon sentèz cDNA ak RNaseH anvan PCR.Pou kèk modèl, li panse ke RNA a nan reyaksyon an sentèz cDNA anpeche obligatwa nan pwodwi anplifye, nan ka sa a tretman an RNaseH ka ogmante sansiblite.Anjeneral, tretman RNaseH obligatwa pou anplifikasyon yon modèl sib cDNA relativman long, tankou tuberous scherosisⅡ ak kopi ki ba.Pou modèl difisil sa a, RNaseH amelyore siyal ki te pwodwi pa cDNA sentèz pa SuperScriptⅡ oswa AMV.Pou pifò reyaksyon RT-PCR, tretman RNaseH opsyonèl paske etap denaturasyon PCR izole 95 ℃ anjeneral idrolize RNA ki soti nan konplèks RNA: DNA.

6. Amelyore metòd pou detekte ti kantite RNA:

RT-PCR se patikilyèman difisil lè sèlman ti kantite RNA ki disponib.Anplis de sa nan glikojèn kòm yon konpayi asirans pandan separasyon RNA ede ogmante sede a nan ti echantiyon.Yon glikojèn RNase-gratis ka ajoute an menm tan ak Trizol.Glikojèn se idrosolubl epi li ka rete nan faz dlo a ak RNA pou ede nan presipitasyon ki vin apre.Konsantrasyon rekòmande nan glikojèn RNase-gratis se 250μg / ml pou echantiyon mwens pase 50mg nan tisi oswa 106 selil kiltive.

Anplis de sa nan BSA acetylated pou ranvèse reyaksyon transkripsyon lè l sèvi avèk SuperScriptⅡ ka ogmante sansiblite a, epi pou ti kantite RNA, diminye kantite SuperScriptⅡ epi ajoute 40 inite RnaseOut nuclease inhibitor ka amelyore nivo deteksyon an.Si yo itilize glikojèn nan separasyon RNA, adisyon BSA oswa RNase inhibiteurs pou ranvèse reyaksyon transkripsyon lè l sèvi avèk SuperScriptⅡ toujou rekòmande.

Ⅱ. Ogmante espesifik RT-PCR

1. sentèz cNDA:

Twa metòd diferan ka itilize pou kòmanse sentèz cDNA premye strand, ak espesifikasyon relatif chak metòd afekte kantite ak kalite cDNA sentèz.

Metòd primè o aza se pi piti espesifik nan twa metòd yo.Jadendantè yo rkwit nan plizyè sit atravè transkripsyon an pou pwodui ADNc ki kout ak yon pati nan longè.Metòd sa a souvan itilize pou jwenn sekans tèminal 5′ ak cDNA ki soti nan modèl RNA ak rejyon estriktirèl segondè oswa ak sit tèminal ki ranvèse transkriptaz pa ka repwodui.Pou jwenn cDNA ki pi long la, yo dwe detèmine rapò primè ak RNA nan chak echantiyon RNA anpirikman.Konsantrasyon inisyal nan primè o aza varye ant 50 ak 250ng pou chak 20μl sistèm reyaksyon.Paske cDNA sentèz soti nan RNA total lè l sèvi avèk primè o aza se sitou RNA ribosomal, poly(A) + RNA jeneralman chwazi kòm modèl la.

Oligo(dT) inisyasyon pi espesifik pase primè o aza.Li ibrid ak poly(A) ke yo jwenn nan fen 3′ mRNA nan pifò selil ekaryotik.Paske poly(A) + RNA se apeprè 1% a 2% nan RNA total, kantite ak konpleksite nan cDNA se anpil mwens pase si yo te itilize primè o aza.Akòz espesifikasyon segondè li yo, oligo (dT) jeneralman pa mande pou optimize pou RNA a rapò Jadendanfan ak seleksyon poly (A) +.Li rekòmande pou itilize 0.5μg oligo (dT) pou chak 20μl sistèm reyaksyon.oligo (dT) 12-18 se apwopriye pou pifò RT-PCR.ThermoScript RT-PCR System bay oligo (dT) 20 paske nan bon estabilite tèmik li yo epi li apwopriye pou pi wo tanperati kenbe.

Gene-specific primers (GSP) se pi bon primè espesifik pou etap transcription ranvèse.GSP se yon oligonukleozid antisans ki ka spesyalman ibrid ak sekans destinasyon RNA, olye ke rna tout Rnas tankou primè o aza oswa oligo (dT).Règ yo itilize pou konsepsyon premye PCR aplike tou nan konsepsyon GSP reyaksyon ranvèse transcription.GSP ka menm sekans kòm primè anplifikasyon an annealed nan fen mRNA3′, oswa GSP ka fèt yo dwe annealed en ak primè anplifikasyon ranvèse a.Pou kèk objè anplifye, li nesesè pou konsepsyon plis pase yon Jadendanfan antisans pou siksè RT-PCR paske estrikti segondè nan RNA sib la ka anpeche Jadendanfan an soti nan obligatwa.Li sijere yo sèvi ak 1pmol antisense GSP nan premye sistèm reyaksyon entèz chèn nan 20μl.

2. Ogmante tanperati prezèvasyon chalè nan transcription ranvèse:

Yo nan lòd yo pran anpil avantaj de spesifik GSP, transkriptaz ranvèse ak estabilite tèmik segondè yo ta dwe itilize.Chalè-ki estab transkriptaz ranvèse ka izole nan tanperati ki pi wo pou ogmante rigor reyaksyon.Pou egzanp, si yon GSP rkwit nan 55 ° C, Lè sa a, espesifik nan GSP pa totalman itilize si transkripsyon ranvèse fèt nan 37 ° C ak rijè ki ba lè l sèvi avèk AMV oswa M-MLV.Sepandan, SuperScripⅡ ak ThermoScript ka reyaji nan 50℃ oswa pi wo, sa ki elimine pwodwi ki pa espesifik ki pwodui nan pi ba tanperati.Pou espesifikasyon maksimòm, yo ka transfere melanj RNA/Jadendanfan an dirèkteman nan tanperati denaturasyon 65 ℃ nan tanperati a kenbe transcription ranvèse ak adisyon a nan yon melanj 2 x reyaksyon prechofe (inisyasyon tèmik nan sentèz cDNA).Sa a ede anpeche baz pè ant molekil nan tanperati ki ba.Sèvi ak yon enstriman PCR senplifye anpil tranzisyon tanperati ki nesesè pou RT-PCR.

3. Diminye kontaminasyon ADN jenomik:

Youn nan difikilte potansyèl ak RT-PCR se ke RNA kontamine ADN jenomik.Itilizasyon pi bon metòd separasyon RNA, tankou Trizol Reagent, diminye kontaminasyon ADN jenomik nan preparasyon RNA.Pou evite pwodwi ki pwodui nan ADN jenomik, RNA a ka trete ak DnasⅠ klas anplifikasyon pou retire ADN ki kontamine anvan transkripsyon ranvèse.Echantiyon yo te kenbe nan 65℃ nan 2.0mM EDTA pou 10 min pou mete fen nan dijesyon DNaseⅠ.EDTA chelate iyon mayezyòm pou anpeche idroliz RNA depandan ion mayezyòm ki fèt nan tanperati ki wo.

Yo nan lòd yo separe cDNA anplifye soti nan pwodwi anplifikasyon ADN genòm, yo ka fèt primè ki rkwit separeman ak ekson ki separe a.Pwodwi PCR ki sòti nan cDNA yo pral pi kout pase sa ki sòti nan ADN jenomik ki kontamine.Yo fè yon eksperyans kontwole san transkripsyon ranvèse tou sou chak modèl RNA pou detèmine si yon fragman bay soti nan ADN jenomik oswa cDNA.Pwodwi PCR yo jwenn nan absans transkripsyon ranvèse yo sòti nan genomic la.

Pwodwi ki gen rapò

RT-PCR fasil^ᵀᴹMwen (yon sèl etap)

-Tout la yon sèl etap pèmèt transkripsyon ranvèse ak PCR yo dwe te pote soti nan tib la menm.Li sèlman bezwen ajoute modèl RNA, premye PCR espesifik ak RNase-Free ddH₂O.

-An tan reyèl analiz quantitative nan RNA ka te pote soti byen vit epi avèk presizyon.

-Tous la sèvi ak yon reyaktif transcription ranvèse Foregene inik ak Foregene HotStar Taq DNA Polymerase konbine avèk yon sistèm reyaksyon inik pou amelyore efikasite anplifikasyon ak espesifik reyaksyon an.

-Sistèm nan reyaksyon optimize fè reyaksyon an gen pi wo sansiblite deteksyon, pi fò estabilite tèmik, ak pi bon tolerans.

RT Easy II (Avèk GDNase) Mèt Premix pou premye-seksyon CDNA sentèz pou PCR an tan reyèl ak GDNase

-Efikas kapasite pou retire gDNA, ki ka retire gDNA nan modèl la nan 2 minit.

-Efikas ranvèse transcription sistèm, li sèlman pran 15 minit pou konplete sentèz premye strand cDNA a.

-Modèl konplèks: modèl ki gen gwo kontni GC ak estrikti segondè konplèks kapab tou ranvèse ak efikasite segondè.

-Segondè sansiblite ranvèse transcription sistèm, pg-nivo modèles kapab tou jwenn bon kalite cDNA.

-Sistèm transkripsyon ranvèse a gen gwo estabilite tèmik, tanperati reyaksyon optimal se 42 ℃, epi li toujou gen bon pèfòmans transkripsyon ranvèse nan 50 ℃.