Materyèl kòmanse: RNA
Quantitative ranvèse transcription PCR (RT-qPCR) se yon metòd eksperimantal yo itilize nan eksperyans PCR lè l sèvi avèk RNA kòm materyèl la kòmanse.Nan metòd sa a, RNA total oswa RNA mesaje (mRNA) premye transkri nan ADN konplemantè (cDNA) pa transkriptaz ranvèse.Imedyatman, yo te fè yon reyaksyon qPCR lè l sèvi avèk cDNA a kòm yon modèl.RT-qPCR te itilize nan yon varyete aplikasyon byoloji molekilè, tankou analiz ekspresyon jèn, validation entèferans RNA, validation microarray, deteksyon patojèn, tès jenetik, ak rechèch maladi.
Metòd yon sèl etap ak de etap pou RT-qPCR
RT-qPCR ka akonpli pa yon metòd yon sèl etap oswa de etap.RT-qPCR yon sèl etap konbine transkripsyon ranvèse ak anplifikasyon PCR, sa ki pèmèt transkriptaz ranvèse ak ADN polymerase konplete reyaksyon an nan menm tib la nan menm kondisyon tanpon yo.RT-qPCR yon sèl-etap sèlman mande pou itilize premye sekans-espesifik.Nan de-etap RT-qPCR, transkripsyon ranvèse ak anplifikasyon PCR yo fèt nan de tib, lè l sèvi avèk diferan tanpon optimize, kondisyon reyaksyon, ak estrateji konsepsyon primè.
| Avantaj | Dezavantaj | |
| Yon etap | Metòd sa a gen mwens erè eksperimantal kòm tou de reyaksyon yo fè nan yon sèl tib
Mwens etap pipetaj diminye risk pou kontaminasyon
Apwopriye pou anplifikasyon / tès depistaj wo-debi, vit ak repwodiktif | Reyaksyon de etap pa ka optimize separeman
Depi kondisyon reyaksyon yo konpwomèt lè yo konbine reyaksyon de etap la, sansiblite a pa bon menm jan ak metòd de etap la.
Nimewo a nan sib detekte pa yon sèl echantiyon se piti |
| De etap | Kapasite pou kreye bibliyotèk cDNA ki estab ki ka estoke pou peryòd tan ki long epi itilize nan plizyè reyaksyon.
Jèn sib ak jèn referans yo ka anplifye nan menm bibliyotèk cDNA san yo pa bezwen plizyè bibliyotèk cDNA.
Tanpon reyaksyon ak kondisyon reyaksyon ki pèmèt optimize kouri reyaksyon sèl
Seleksyon fleksib nan kondisyon deklanche | Sèvi ak plizyè tib, ak plis etap pipete ogmante risk pou kontaminasyon ADN, ak tan konsome.
Mande plis optimize pase metòd la yon sèl etap |
Pwodwi ki gen rapò:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (One Step)-SYBR Green I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (yon sèl etap)-Taqman
RT Easyᵀᴹ I Master Premix Pou Premye Seksyon CDNA Sentèz
Tan reyèl PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Twous
Seleksyon RNA total ak mRNA
Lè w ap desine yon eksperyans RT-qPCR, li enpòtan pou w deside si w ap itilize RNA total oswa mRNA pirifye kòm yon modèl pou transkripsyon ranvèse.Malgre ke mRNA ka bay yon ti kras pi wo sansiblite, RNA total yo toujou itilize souvan.Rezon ki fè sa a se ke RNA total gen yon avantaj ki pi enpòtan kòm yon materyèl kòmanse pase mRNA.Premyèman, pwosesis la mande pou mwens etap pirifikasyon, ki asire pi bon rekiperasyon quantitative nan modèl ak pi bon nòmalizasyon rezilta yo kòmanse nimewo selil yo.Dezyèmman, li evite etap anrichisman mRNA a, sa ki ka evite posiblite pou rezilta dekonpoze akòz rekiperasyon diferan nan mRNA diferan.An jeneral, depi nan pifò aplikasyon pou quantification relatif jèn sib la pi enpòtan pase sansiblite absoli deteksyon an, total RNA pi apwopriye nan pifò ka yo.
Jadendanfan transcription ranvèse
Nan metòd de etap la, yo ka itilize twa metòd diferan pou premye reyaksyon cDNA a: primè oligo(dT), primè o aza, oswa primè sekans espesifik.Tipikman, primè oligo (dT) ak primè o aza yo itilize nan konbinezon.Jadendanfan sa yo rkwit sou strand mRNA modèl la epi yo bay transkriptaz ranvèse ak yon pwen depa pou sentèz.
| Primer seleksyon | Estrikti ak fonksyon | Avantaj | Dezavantaj |
| Jadendanfan Oligo (dT) (oswa ancrage oligo (dT) Jadendanfan) | Annealing pwolonje nan résidus thymine nan ke poly(A) mRNA;Anchor oligo(dT) primè gen yon G, C, oswa A nan fen 3′ (sit lank) | Sentèz cDNA plen longè soti nan mRNA poly(A)-tailed
Aplikab lè mwens materyèl kòmanse disponib
Sit ancrage asire ke primè oligo(dT) la mare ak 5′ ke poly(A) mRNA a. | Sèlman apwopriye pou anplifye jèn ak ke poly(A).
Jwenn cDNA tronke nan sit priming la*2 nan poly(A)
Patipri pou mare nan fen 3′*
*Ou minimize posiblite sa a si yo itilize primer oligo(dT) ancrage |
| Jadendanfan o aza
| 6 a 9 baz nan longè, ki ka anneal nan plizyè sit pandan transcription RNA | Rantre tout RNAs (tRNA, rRNA, ak mRNA)
Apwopriye pou relve nòt ki gen estrikti segondè enpòtan, oswa lè mwens materyèl kòmanse disponib
Segondè pwodiksyon cDNA | cDNA se ranvèse transkri soti nan tout RNA, ki anjeneral pa vle epi li ka delye siyal mRNA sib la.
jwenn cDNA tronke |
| premye sekans espesifik | Koutim primè ki vize sekans mRNA espesifik | bibliyotèk cDNA espesifik
Amelyore sansiblite
Sèvi ak ranvèse primar qPCR | Sèlman limite a sentèz yon sèl jèn sib |
Transkriptaz ranvèse
Reverse transcriptase se yon anzim ki itilize RNA pou fè sentèz ADN.Gen kèk transkriptaz ranvèse ki gen aktivite RNase epi yo ka degrade seksyon RNA nan seksyon ibrid RNA-DNA apre transkripsyon.Si li pa gen aktivite anzimatik RNase, RNaseH ka ajoute pou pi wo efikasite qPCR.Souvan itilize anzim yo enkli Moloney murin lesemi viris ranvèse transkriptaz ak mieloblastom avyè transkriptaz ranvèse.Pou RT-qPCR, li se ideyal yo chwazi yon transkriptaz ranvèse ki gen pi wo thermostabilité, pou sentèz cDNA ka fèt nan pi wo tanperati, asire transkripsyon siksè nan RNAs ak pi wo estrikti segondè, pandan y ap kenbe tout aktivite yo nan tout reyaksyon an, sa ki lakòz pi wo pwodiksyon cDNA.
Pwodwi ki gen rapò:
Foreasy M-MLV Reverse Transcriptase
Aktivite RNase H nan transkriptaz ranvèse
RNaseH se kapab degrade seksyon RNA nan duplex RNA-DNA, sa ki pèmèt sentèz efikas nan ADN doub-chèn.Sepandan, lè w ap itilize mRNA long kòm yon modèl, RNA a ka degrade prematireman, sa ki lakòz cDNA tronke.Se poutèt sa, li souvan benefisye pou misyon pou minimize aktivite RNaseH pandan klonaj cDNA si sentèz transkripsyon long yo vle.Kontrèman, transkriptaz ranvèse ak aktivite RNase H yo souvan benefisye pou aplikasyon qPCR paske yo amelyore k ap fonn duplex RNA-DNA pandan premye sik PCR la.
Premye konsepsyon
Jadendanfan PCR yo itilize pou etap qPCR la nan RT-qPCR yo ta dwe depreferans fèt pou span yon junction exon-exon, kote yon primè anplifikasyon kapab potansyèlman span yon fwontyè aktyèl ekson-intron.Piske sekans ADN genomik ki gen entron yo pa anplifye, konsepsyon sa a diminye risk pou fo pozitif ki anplifye nan kontamine ADN jenomik.
Si primè pa ka fèt pou separe ekson oswa fwontyè ekson-ekson, li ka nesesè pou trete echantiyon RNA ak DNase I oswa dsDNase ki pa gen RNase pou retire kontaminasyon ADN jenomik.
RT-qPCR kontwòl
Yon kontwòl negatif transkripsyon ranvèse (-RT kontwòl) ta dwe enkli nan tout eksperyans RT-qPCR pou detekte kontaminasyon ADN (tankou ADN jenomik oswa pwodwi PCR ki soti nan reyaksyon anvan yo).Kontwòl sa a gen tout eleman reyaksyon eksepte transkriptaz ranvèse.Depi transkripsyon ranvèse pa rive ak kontwòl sa a, si yo obsève anplifikasyon PCR, kontaminasyon nan ADN gen plis chans.
Tan pòs: 02-aout 2022
