• PCR se yon metòd ki itilize pou anplifye ADN nan yon ti kantite modèl ADN.RT-PCR itilize transkripsyon ranvèse pou pwodui yon modèl ADN ki soti nan yon sous RNA ki ka anplifye.
• PCR ak RT-PCR yo tipikman reyaksyon pwen final, pandan y ap qPCR ak RT-qPCR itilize sinetik pousantaj sentèz pwodwi pandan reyaksyon PCR la pou evalye kantite modèl prezan.
• Metòd ki pi nouvo yo, tankou PCR dijital, bay kantite absoli modèl ADN inisyal la, pandan y ap metòd tankou PCR izotèmik redwi nesesite pou ekipman chè pou bay rezilta serye.

Reyaksyon chèn polymerase (PCR) se yon teknik byoloji molekilè relativman senp epi lajman itilize pou anplifye ak detekte sekans ADN ak RNA.Konpare ak metòd tradisyonèl nan klonaj ADN ak anplifikasyon, ki ka souvan pran jou, PCR mande pou sèlman kèk èdtan.PCR se trè sansib epi li mande yon modèl minim pou deteksyon ak anplifikasyon sekans espesifik.Metòd PCR debaz yo te avanse pi lwen soti nan deteksyon senp ADN ak RNA.Anba a, nou bay yon apèsi sou diferan metòd PCR ak reyaktif nou bay nan Enzo Life Sciences pou bezwen rechèch ou yo.Nou vize pou ede syantis yo byen vit jwenn aksè nan reyaktif PCR pou itilize nan pwochen pwojè rechèch yo!

PCR

Pou PCR estanda, tout sa ou bezwen se yon ADN polymerase, mayezyòm, nukleotid, primè, modèl ADN yo dwe anplifye, ak yon thermocycler.Mekanis PCR la senp menm jan ak objektif li: 1) ADN doub-chaj (dsDNA) se chalè denatire, 2) Jadendanfan yo aliman ak yon sèl fil ADN yo, epi 3) Jadendanfan yo pwolonje pa ADN polymerase, sa ki lakòz de kopi a. seksyon ADN orijinal la.Pwosesis denaturasyon, annealing, ak elongasyon sou yon seri tanperati ak tan ke yo rekonèt kòm yon sik anplifikasyon (figi 1).

Chak etap nan sik la ta dwe optimize pou modèl la ak seri Jadendanfan yo itilize.Sik sa a repete apeprè 20-40 fwa, epi yo ka analize pwodwi anplifye a, tipikman pa jèl agarose (figi 2).

Kòm PCR se yon metòd trè sansib epi yo mande ti volim pou yon sèl reyaksyon, yo rekòmande preparasyon yon melanj mèt pou plizyè reyaksyon.Melanj mèt la dwe byen melanje ak Lè sa a, divize pa kantite reyaksyon, asire ke chak reyaksyon ap gen menm kantite anzim, dNTPs, ak primè.Anpil founisè, tankou Enzo Life Sciences, ofri tou melanj PCR ki deja genyen tout bagay eksepte primè ak modèl ADN.

Rejyon Guanine/Cytosine ki rich (GC ki rich) reprezante yon defi nan teknik PCR estanda.Sekans GC ki rich yo pi estab pase sekans ki gen pi ba kontni GC.Anplis de sa, sekans GC ki rich yo gen tandans fòme estrikti segondè, tankou bouk epengl.Kòm yon rezilta, seksyon doub GC ki rich yo difisil pou konplètman separe pandan faz denaturasyon an.Kontinwe, ADN polymerase pa ka fè sentèz nouvo fil la san antrav.Yon tanperati denaturasyon ki pi wo ka amelyore sa a, ak ajisteman nan direksyon pou yon tanperati rkwir ki pi wo ak tan rkwit ki pi kout ka anpeche obligatwa ki pa espesifik nan primè ki rich ak GC.Reyaktif adisyonèl ka amelyore anplifikasyon nan sekans GC ki rich.DMSO, glycerol, ak betaine ede deranje estrikti segondè yo ki te koze pa entèraksyon GC epi kidonk fasilite separasyon doub fil yo.

Hot Start PCR

Anplifikasyon ki pa espesifik se yon pwoblèm ki ka rive pandan PCR.Pifò ADN polymeraz yo itilize pou PCR travay pi byen nan tanperati alantou 68 ° C a 72 ° C.Sepandan, anzim la ka aktif nan tanperati ki pi ba, byenke nan yon degre pi ba.Nan tanperati byen lwen anba tanperati rkwit, primè ka mare ki pa espesifikman epi mennen nan anplifikasyon ki pa espesifik, menm si reyaksyon an mete sou glas.Sa a ka anpeche lè w itilize inibitè polymerase ki separe de ADN polymerase sèlman yon fwa yo rive nan yon sèten tanperati, kidonk tèm PCR kòmanse cho.Inibitè a kapab yon antikò ki mare polymerase a ak denatire nan tanperati denaturasyon inisyal la (95 ° C tipikman).

Segondè Fidelite Polymerase

Pandan ke ADN polymerases anplifye jistis ak sekans modèl orijinal la, erè nan matche nukleotid ka rive.Diferans nan aplikasyon tankou klonaj ka lakòz transkripsyon twonke, ak pwoteyin mal tradui oswa inaktif en.Pou evite dezakò sa yo, yo te idantifye polymerases ki gen yon aktivite "correkti" e yo te enkòpore nan workflow la.Premye polymerase koreksyon an, Pfu, te idantifye an 1991 nan Pyrococcus furiosus.Anzim Pfu sa a gen yon aktivite eksonukleaz 3' a 5'.Pandan ADN an anplifye, eksonukleaz la retire nukleotid ki pa matche ak nan fen 3' seksyon an.Lè sa a, nukleotid ki kòrèk la ranplase, epi sentèz ADN ap kontinye.Idantifikasyon sekans nukleotid ki pa kòrèk baze sou afinite obligatwa pou trifosfat nukleozid ki kòrèk la ak anzim la, kote lyezon ki pa efikas ralanti sentèz la epi pèmèt ranplasman kòrèk la.Aktivite koreksyon Pfu polymerase rezilta nan mwens erè nan sekans final la konpare ak Taq DNA polymerase.Nan dènye ane yo, yo te idantifye lòt anzim koreksyon, epi yo te fè modifikasyon nan anzim Pfu orijinal la pou plis diminye pousantaj erè pandan anplifikasyon ADN.

RT-PCR

PCR ranvèse transcription, oswa RT-PCR, pèmèt itilizasyon RNA kòm yon modèl.Yon etap adisyonèl pèmèt deteksyon ak anplifikasyon RNA.RNA a transkri inverse nan ADN konplemantè (cDNA), lè l sèvi avèk transkriptaz ranvèse.Kalite ak pite modèl RNA yo esansyèl pou siksè RT-PCR.Premye etap RT-PCR se sentèz yon ibrid ADN/RNA.Transkriptaz ranvèse tou gen yon fonksyon RNase H, ki degrade pòsyon RNA nan ibrid la.Lè sa a, molekil ADN yon sèl-chache la konplete pa aktivite ADN-depandan ADN polymerase nan transkriptaz ranvèse a nan cDNA.Efikasite nan premye-strand reyaksyon an ka afekte pwosesis anplifikasyon an.Soti isit la, yo itilize pwosedi PCR estanda pou anplifye cDNA a.Posiblite pou retounen RNA nan cDNA pa RT-PCR gen anpil avantaj, epi li se sitou itilize pou analiz ekspresyon jèn.RNA se yon sèl-blon ak trè enstab, ki fè li difisil pou travay avèk yo.Li souvan sèvi kòm yon premye etap nan qPCR, ki quantifies transkripsyon RNA nan yon echantiyon byolojik.

qPCR ak RT-qPCR

Yo itilize PCR quantitative (qPCR) pou detekte, karakterize ak quantifier asid nikleyik pou plizyè aplikasyon.Nan RT-qPCR, transkripsyon RNA yo souvan quantifier pa ranvèse transkripsyon yo nan cDNA an premye, jan sa dekri pi wo a, ak Lè sa a, qPCR imedyatman te pote soti.Kòm nan PCR estanda, ADN anplifye pa twa etap repete: denaturasyon, annealing, ak elongasyon.Sepandan, nan qPCR, etikèt fliyoresan pèmèt koleksyon done yo pandan PCR ap pwogrese.Teknik sa a gen anpil avantaj akòz seri metòd ak chimi ki disponib.

Nan qPCR ki baze sou lank (tipikman vèt), etikèt fliyoresan pèmèt quantification molekil ADN anplifye yo lè li itilize yon lank obligatwa dsDNA.Pandan chak sik, yo mezire fluoresans la.Siyal fliyoresans la ogmante pwopòsyonèlman ak kantite ADN replike.Pakonsekan, se ADN nan quantifye an "an tan reyèl" (Fig. 3).Dezavantaj yo nan qPCR ki baze sou lank yo se ke yon sèl sib ka egzamine nan yon moman epi ke lank la pral mare nan nenpòt ds-ADN prezan nan echantiyon an.

Nan qPCR ki baze sou pwofonde, yo ka detekte anpil sib an menm tan nan chak echantiyon, men sa mande pou optimize ak konsepsyon yon pwofonde espesifik (yo) itilize anplis de primè.Plizyè kalite konsepsyon sond ki disponib, men kalite ki pi komen an se yon pwofonde idroliz, ki enkòpore yon fliyofò ak quencher.Fluoresans sonans enèji transfè (FRET) anpeche emisyon fluorophore a atravè quencher la pandan pwofonde a se entak.Sepandan, pandan reyaksyon PCR la, pwofonde a idrolize pandan ekstansyon Jadendanfan ak anplifikasyon sekans espesifik li mare a.Klivaj pwofonde a separe fluorophore a ak quencher a epi rezilta nan yon ogmantasyon anplifikasyon-depandan nan fluoresans (figi 4).Kidonk, siyal fliyoresan ki soti nan yon reyaksyon qPCR ki baze sou pwofonde pwopòsyonèl ak kantite sekans sib pwofonde ki prezan nan echantiyon an.Paske qPCR ki baze sou sond pi espesifik pase qPCR ki baze sou koloran, li se souvan teknoloji ki itilize nan tès dyagnostik ki baze sou qPCR.

Anplifikasyon izotèmik

Teknik PCR mansyone pi wo a mande pou ekipman thermocycling chè pou monte ak desann tanperati chanm avèk presizyon pou etap denaturasyon, rkwit ak ekstansyon.Yo te devlope yon kantite teknik ki pa bezwen aparèy presi sa yo epi yo ka fè nan yon beny dlo senp oswa menm nan selil ki enterese yo.Teknik sa yo kolektivman rele anplifikasyon izotèmik ak travay ki baze sou eksponansyèl, lineyè, oswa anplifikasyon kaskad.

Kalite anplifikasyon izotèmik ki pi byen koni se anplifikasyon izotèmik ki fèt ak bouk, oswa LAMP.LAMP itilize anplifikasyon eksponansyèl nan 65⁰C pou anplifye ADN oswa RNA modèl.Lè w ap fè LAMP, kat a sis primè konplemantè ak rejyon ADN sib la yo itilize ak yon ADN polymerase pou fè sentèz nouvo ADN.De nan primè sa yo gen sekans flater ki rekonèt sekans nan lòt primè yo epi mare yo, sa ki pèmèt yon estrikti "bouk" fòme nan ADN ki fèk sentèz la ki Lè sa a, ede rkwir primè nan jij anplifikasyon ki vin apre yo.LAMP ka vizyalize pa plizyè metòd, ki gen ladan fliyoresans, elektwoforèz jèl agaroz, oswa kolorimetri.Fasilite pou vizyalize ak detekte prezans oswa absans pwodwi pa kolorimetri ak mank de ekipman chè obligatwa te fè LAMP yon opsyon apwopriye pou tès SARS-CoV-2 nan zòn kote tès klinik laboratwa pa t fasil disponib, oswa depo ak transpò echantiyon yo genyen. pa t posib, oswa nan laboratwa ki pa te gen ekipman PCR thermocycling.