Li se byen li te ye ke nan dogm santral la, RNA se medyatè transcription ant ADN ak ekspresyon pwoteyin.Konpare ak deteksyon ADN, deteksyon RNA ka reflete plis objektivman ekspresyon jèn nan òganis yo.Eksperyans ki enplike RNA yo enkli: qRT-PCR, RNA-Seq, ak deteksyon jèn fizyon, elatriye. Baze sou karakteristik RNA li menm (bag sik RNA a gen yon gwoup idroksil plis gratis pase bag sik ADN), makonnen ak yon gwo kantite RNases nan anviwònman an, RNA se pi enstab ak pi fasil yo degrade pase ADN.Fatra nan, fatra soti, si bon jan kalite a nan RNA se pa bon, Lè sa a, rezilta yo eksperimantal yo dwe satisfezan, espesyalman manifeste kòm done ki pa kòrèk oswa repetibilite pòv.Se poutèt sa, yo ta dwe peye plis atansyon sou pwosesis la nan RNA, ak lyen an nan kontwòl kalite se tou pi enpòtan asire presizyon ak presizyon nan done eksperimantal ki vin apre.

Pou kontwòl kalite RNA, gen jeneralman metòd sa yo souvan itilize:

• Spectrophotometry
• elektwoforèz jèl agaroz
• Agilent Bioanalyzer
• an tan reyèl fluoresan PCR quantitative
• Metòd lank fluorescent Qubit

01 Spectrophotometry

RNA gen lyezon doub konjige epi li gen yon pik absòpsyon nan yon longèdonn 260nm.Dapre lwa Lambert-Beer a, nou ka kalkile konsantrasyon RNA nan pik absòpsyon nan 260nm.Anplis de sa, nou ka tou kalkile pite a nan RNA dapre rapò a nan pik absòpsyon 260nm, 280nm ak 230nm.280nm ak 230nm se pik absòpsyon pwoteyin ak ti molekil, respektivman.Rapò A260/A280 ak A260/A230 nan pite RNA ki kalifye yo ta dwe pi gran pase 2. Si li se mwens pase 2, sa vle di ke gen pwoteyin oswa ti molekil kontaminasyon nan echantiyon RNA a epi li bezwen pirifye ankò.Sous kontaminasyon yo pral afekte eksperyans en, tankou anpeche efikasite anplifikasyon nan reyaksyon PCR, sa ki lakòz rezilta quantitative kòrèk.Pite RNA a gen yon gwo enfliyans sou rezilta ki vin apre yo, kidonk espektrofotometri se jeneralman yon lyen kontwòl kalite endispansab nan premye etap la nan eksperyans asid nikleyik.

Figi 1. Spectrum absòpsyon RNA/DNA tipik

02 Elektwoforèz jèl agaroz

Anplis de sa nan pite, entegrite nan RNA se tou youn nan endikatè yo enpòtan pou jije bon jan kalite a nan RNA.Degradasyon RNA pral mennen nan yon gwo kantite fragman kout nan echantiyon an, kidonk kantite fragman RNA ki ka efektivman detekte ak kouvri pa sekans referans la ap redwi.Entegrite RNA ka tcheke pa elektwoforèz RNA total sou yon jèl agarose 1%.Metòd sa a ka konfigirasyon jèl la tèt ou, oswa itilize sistèm E-Gel™ prefabrike pou tès entegrite.Plis pase 80% total de RNA se ribosomal RNA, majorite nan ki konpoze de 28S ak 18S rRNA (nan sistèm mamifè).Bon jan kalite RNA pral montre de ba klè klè, ki se 28S ak 18S ba klere, respektivman, nan 5 Kb ak 2 Kb, ak rapò a pral gen tandans yo dwe fèmen nan 2:1.Si li nan yon eta difize, sa vle di ke echantiyon RNA a ka te degrade, epi li rekòmande pou itilize metòd ki dekri pita pou plis teste bon jan kalite a nan RNA.

Figi 2. Konparezon RNA degrade (liy 2) ak entak (liy 3) sou elektwoforèz jèl agarose

03 Agilent Bioanalyzer

Anplis de metòd elèktroforèz jèl agarose ki dekri pi wo a, ki ka ede nou idantifye entegrite RNA tou senpleman ak byen vit, nou ka tou itilize bioanalyzer Agilent pou detèmine entegrite RNA.Li sèvi ak yon konbinezon de mikrofluidik, elektwoforèz kapilè, ak fliyoresans pou evalye konsantrasyon RNA ak entegrite.Lè w itilize algorithm entegre pou analize pwofil echantiyon RNA a, bioanalyzer Agilent ka kalkile yon valè entegrite RNA referans, Nimewo Entegrite RNA (ki rele RIN) [1].Pi gwo valè RIN, se pi gwo entegrite RNA a (1 trè degrade, 10 se pi konplè).Gen kèk eksperyans ki enplike RNA sijere itilize RIN kòm yon paramèt pou evalyasyon kalite.Lè w ap pran eksperyans sekans segondè-debi (apwe sa yo rele NGS) kòm yon egzanp, direktiv yo nan Oncomine™ Repètwa Iminitè Imèn, ki itilize pou detekte reseptè selil B ak selil T nan seri panèl Oncomine Thermo Fisher a, sijere ke echantiyon ki gen valè RIN ki pi gran pase 4, Lekti ak klonaj pi efikas yo ka mezire (Figi 3).Gen diferan ranje rekòmande pou diferan panno, e souvan yon RIN ki pi wo ka pote done pi efikas.

Figi 3, nan eksperyans Oncomine™ Iminitè Repètwa, echantiyon ki gen RIN ki pi gran pase 4 ka detekte lekti ki pi efikas ak klon selil T.【2】

Sepandan, valè RIN tou gen kèk limit.Malgre ke RIN gen yon gwo korelasyon ak bon jan kalite a nan done eksperimantal NGS, li pa apwopriye pou echantiyon FFPE.Echantiyon FFPE yo te trete chimikman pou yon tan long, ak RNA a ekstrè jeneralman gen yon valè RIN relativman ba.Sepandan, sa pa vle di ke done yo efikas nan eksperyans la dwe satisfezan.Pou evalye avèk presizyon bon jan kalite echantiyon FFPE, nou bezwen sèvi ak lòt mezi pase RIN.Anplis RIN, Agilent bioanalyzer kapab tou kalkile valè DV200 kòm yon paramèt evalyasyon kalite RNA.DV200 se yon paramèt ki kalkile pwopòsyon fragman ki pi gwo pase 200 bp nan yon echantiyon RNA.DV200 se yon pi bon endikatè bon jan kalite echantiyon FFPE pase RIN.Pou RNA a ekstrè pa FFPE, li gen yon korelasyon trè wo ak kantite jèn ki ka efektivman detekte ak divèsite jèn [3].Malgre ke DV200 ka fè moute pou defisyans yo nan deteksyon an bon jan kalite nan FFPE, bioanalyzer Agilent la toujou pa ka analize konplè pwoblèm yo bon jan kalite nan echantiyon RNA, ki gen ladan si gen inibitè nan echantiyon yo.Inibitè tèt yo ka afekte efikasite anplifikasyon nan eksperyans en epi redwi kantite done itil.Pou konnen si gen yon inibitè nan echantiyon an, nou ka adopte metòd PCR quantitative fluorescent an tan reyèl ki dekri pwochen an.

04 an tan reyèl fluoresan PCR quantitative

Metòd PCR quantitative fliyoresan an tan reyèl la pa sèlman ka detekte inibitè yo nan echantiyon an, men tou, avèk presizyon reflete bon jan kalite RNA nan echantiyon FFPE a.Konpare ak analizeur byolojik Agilent, enstriman kantitatif fluoresans an tan reyèl yo pi popilè nan pi gwo laboratwa byolojik akòz aplikasyon pi laj yo.Pou teste bon jan kalite echantiyon RNA, nou sèlman bezwen achte oswa prepare sond primè pou jèn referans entèn yo, tankou GUSB (Cat No. Hs00939627).Lè w sèvi ak seri sa a nan primè, sond ak estanda (total RNA nan konsantrasyon li te ye) pou fè eksperyans quantitative absoli, yo ka kalkile konsantrasyon fragman RNA efikas kòm estanda evalyasyon bon jan kalite RNA (Fonksyonèl RNA Quantitation (FRQ) pou kout).Nan yon tès NGS, nou te jwenn ke FRQ echantiyon RNA yo gen yon korelasyon trè wo ak volim done efikas.Pou tout echantiyon ki pi gran pase 0.2ng/uL FRQ, omwen 70% nan lekti yo ka efektivman kouvri sekans referans lan (Figi 4).

Figi 4, valè FRQ detekte pa metòd quantitative fluoresans la gen yon korelasyon trè wo (R2> 0.9) ak done efikas yo jwenn nan eksperyans NGS la.Liy wouj la se valè FRQ ki egal a 0.2 ng/uL (log10 = -0.7).【4】

Anplis de sa yo aplikab pou echantiyon FFPE, metòd PCR quantitative an tan reyèl kapab tou kontwole efikasman inibitè nan echantiyon yo.Nou ka ajoute echantiyon an yo dwe detekte nan sistèm reyaksyon an ak Kontwòl Pozitif Entèn (IPC) ak Esay li yo, ak Lè sa a, fè quantification fluoresans pou jwenn valè Ct la.Si valè Ct la dèyè valè Ct nan reyaksyon san echantiyon an, li endike ke inibitè a prezan nan echantiyon an epi anpeche efikasite anplifikasyon nan reyaksyon an.

05 Qubit metòd lank fluorescent

Qubit Fluorometer se ti aparèy ki pi souvan itilize pou konsantrasyon asid nikleyik ak deteksyon pite, ki fasil pou opere epi ki egziste nan prèske chak laboratwa byoloji molekilè.Li kalkile avèk presizyon konsantrasyon asid nikleyik pa detekte ak asid nikleyè obligatwa lank fliyoresan (reyaktif deteksyon Qubit).Qubit gen gwo sansiblite ak espesifik, epi li ka byen mezire RNA jiska konsantrasyon pg/µL.Anplis kapasite ki byen koni pou byen mezire konsantrasyon asid nikleyik, dènye nouvo modèl Thermo Fisher a, Qubit 4.0, kapab tou detekte entegrite RNA.Qubit 4.0's RNA deteksyon sistèm (RNA IQ Assay) detekte entegrite nan RNA pa an menm tan detekte de koloran fliyoresan espesifik.De koloran fliyoresan sa yo ka mare nan gwo fragman ak ti fragman RNA, respektivman.De koloran fliyoresan sa yo endike pwopòsyon gwo fragman RNA nan echantiyon an, epi yo ka kalkile valè IQ (Entegrite ak Kalite) ki reprezante bon jan kalite RNA a.Valè IQ a aplikab pou tou de echantiyon FFPE ak echantiyon ki pa FFPE, e li gen yon gwo enfliyans sou bon jan kalite sekans ki vin apre a.Lè w pran eksperyans NGS kòm egzanp, nan eksperyans tès RNA-Seq yo te fè sou platfòm Ion torrent™, pifò echantiyon ki gen valè IQ ki pi gran pase 4 te gen omwen 50% lekti efikas (Figi 5).Konpare ak metòd deteksyon ki mansyone anwo yo, Qubit IQ Assay se pa sèlman pi pratik pou opere epi li pran mwens tan (nan senk minit), men tou, gen yon gwo korelasyon ant valè IQ paramèt mezire ak bon jan kalite done eksperyans en.

Figi 5, gen yon gwo korelasyon ant valè Qubit RNA IQ a ak lekti kat RNA-Seq yo.【5】

Atravè entwodiksyon ki pi wo a, mwen kwè ke tout moun gen yon konpreyansyon ase sou diferan metòd kontwòl kalite RNA.Nan pratik, ou ka chwazimetòd ki koresponn lan dapre kalite echantiyon an ak enstriman ki deja egziste.Se sèlman lè nou kontwole bon jan kalite a nan RNA byen nou ka evite echèk nan eksperyans ki vin apre ki te koze pa bon jan kalite echantiyon pòv, kidonk ekonomize tan presye, enèji ak pri.

Pwodwi referans:

Animal Total RNA izole Twous

Twous izolasyon RNA total selilè

referans

【1】Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.RIN a: yon nimewo entegrite RNA pou bay valè entegrite nan mezi RNA.BMC Molekilè Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Oncomine Gid Iminitè Repètwa Iminitè Imèn (Pub. No. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Enhanced Quality Metrics for Assessing RNA Derived From Archival Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissus Samples, Toxicological Sciences, Volim 170, Out Paj 2375192https://doi.org/10.1093/toxsci/