1. Premye konpreyansyon

Nan etap sa a, nou bezwen konprann kèk konsèp ak tèminoloji, pou nou evite fè erè devan granmoun nou yo, tankou:

K: Ki diferans ki genyen ant RT-PCR, qPCR, PCR an tan reyèl, ak RT-PCR an tan reyèl?

Repons: RT-PCR se PCR ranvèse transcription(PCR ranvèse transcription, RT-PCR), ki se yon varyant lajman itilize nan reyaksyon chèn polymerase (PCR).Nan RT-PCR, yon strand RNA transkri inverse nan ADN konplemantè, ki Lè sa a, itilize kòm yon modèl pou anplifikasyon ADN pa PCR.
An tan reyèl-PCR ak qPCR(Kantitatif Rea-ltime-PCR) yo se menm bagay la, tou de se PCR quantitative an tan reyèl, ki vle di ke chak sik nan PCR gen dosye done an tan reyèl, kidonk kantite modèl kòmanse ka ajiste analiz presi.

Malgre ke tou de an tan reyèl PCR (an tan reyèl fluorescent quantitative PCR) ak Reverse transcription PCR (reverse transcription PCR) sanble yo dwe abreje kòm RT-PCR, konvansyon entènasyonal la se: RT-PCR espesyalman refere a ranvèse transcription.PCR, an tan reyèl PCR jeneralman abreje kòm qPCR (quantitative an tan reyèl PCR).

Ak an tan reyèl RT-PCR (RT-qPCR), li se PCR ranvèse transkripsyon an konbine avèk teknoloji fliyoresan quantitative.: premye jwenn cDNA (RT) nan transcription ranvèse RNA, epi answit sèvi ak PCR an tan reyèl pou analiz quantitative (qPCR).Pifò laboratwa fè RT-qPCR, se sa ki, rechèch sou RNA ekspresyon desann-règleman, kidonk qPCR ke tout moun pale sou nan laboratwa a aktyèlman refere a RT-qPCR, men pa bliye ke gen toujou anpil tès ADN nan aplikasyon klinik.Analiz kantitatif, tankou deteksyon HBV viris epatit B.

Kesyon: Apre ou fin li anpil PCR fliyoresan quantitative, poukisa yo ta dwe kontwole fragman anplifye a nan seri 80-300bp?

Repons: Longè chak sekans jèn diferan, gen kèk kb plizyè, kèk se dè santèn de bp, men nou sèlman bezwen mande pou longè pwodwi a dwe 80-300bp lè konsepsyon primè, twò kout oswa twò lontan yo pa apwopriye pou deteksyon PCR fliyoresan quantitative.Fragman pwodwi a twò kout pou yo ka distenge ak Jadendanfan-dimer la.Longè Jadendanfan-dimè a se sou 30-40bp, epi li difisil pou distenge si li se yon Jadendanfan-dimè oswa yon pwodwi si li se mwens pase 80bp.Si fragman pwodwi a twò lontan, depase 300bp, li pral fasilman mennen nan efikasite anplifikasyon ki ba epi li pa ka efektivman detekte kantite jèn nan.

Pa egzanp, lè w konte konbyen moun ki nan yon salklas, ou bezwen sèlman konte konbyen bouch ki genyen.Menm bagay la tou se vre lè ou detekte jèn, ou sèlman bezwen detekte yon sèten sekans nan yon jèn reprezante Sekans a tout antye pral fè.Si ou vle konte moun, ou bezwen konte tou de bouch ak nen, zòrèy, ak linèt, epi li fasil pou fè erè.

Pou elaji, nan rechèch byolojik, gen anpil ka rechèch soti nan pwen nan zòn, paske sekans jèn nan nenpòt ki espès se trè long, li nesesè ak enposib mezire tout fragman, tankou sekans bakteri 16S, ki se pote soti nan sekans nan konsèvatif nan Esay bakteri yo dedwi kantite yon sèten popilasyon nan bakteri.

K: Ki longè pi bon pou konsepsyon Jadendanfan qPCR?

Repons: Anjeneral pale, longè Jadendanfan an se sou 20-24bp, ki se pi bon.Natirèlman, nou dwe peye atansyon sou valè TM nan Jadendanfan a lè konsepsyon Jadendanfan an, paske sa a se ki gen rapò ak tanperati a rkwir optimal.Apre yon anpil nan eksperyans, li te pwouve ke 60 ° C se yon pi bon valè TM.Si tanperati rkwit la twò ba, li pral fasilman mennen nan anplifikasyon ki pa espesifik.Si tanperati rkwit la twò wo, efikasite anplifikasyon an ap relativman ba, pik koub anplifikasyon an ap kòmanse pita, epi valè CT a pral retade.

K: Ki jan metòd lank lan diferan de metòd sonde la?

Repons: metòd DyeGen kèk koloran fliyoresan, tankou SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, elatriye, pa emèt limyè poukont yo, men yo pral emèt fliyoresan apre yo fin mare groove a minè nan ADN doub-bloke.Se poutèt sa, nan kòmansman an nan reyaksyon an PCR, machin nan pa ka detekte siyal la fliyoresan.Lè reyaksyon an rive nan etap annealing-extension, doub strand la louvri, epi yon nouvo strand sentèz anba aksyon an nan ADN polymerase, ak molekil fliyoresan an mare nan dsDNA minè Groove la.Kòm kantite sik PCR ogmante, pi plis ak plis koloran yo konbine avèk ADN doub-bloke, epi siyal fliyoresan an tou kontinyèlman amelyore.Metòd lank la se sitou itilize nan rechèch syantifik.
PS: Fè atansyon lè w ap fè eksperyans lan, lank la dwe konbine avèk ADN imen, fè atansyon pou li tounen yon moun fliyoresan.

Metòd Dye (agòch) Metòd sond (adwat)
PS: Fè atansyon lè w ap fè eksperyans lan, lank la dwe konbine avèk ADN imen, fè atansyon pou li tounen yon moun fliyoresan.

SYBR Green Ⅰ mare nan ti renur ADN

Metòd sondeSond Taqman se sond idwoliz ki pi souvan itilize.Gen yon gwoup fliyoresan nan fen 5′ nan sond la, anjeneral, FAM, ak pwofonde nan tèt li se yon sekans konplemantè jèn nan sib.Gen yon gwoup fliyoresan trempe nan fen 3′.Dapre prensip transfè enèji resonans fluoresans (Förster resonance enèji transfè, FRET), lè gwoup fluorescent repòtè a (donatè fluorescent molekil) ak gwoup fliyoresan trempe (molekil fluorescent aseptè) eksite Lè spectre yo sipèpoze ak distans la trè pre (7-10nm), eksitasyon an nan molekil fliyoresan a, pandan y ap asepte molekil la nan fluorescent, nan fluorescent molekil la. nce ap febli.Se poutèt sa, nan kòmansman an nan reyaksyon an PCR, lè pwofonde a gratis ak entak nan sistèm nan, gwoup la fliyoresan repòtè pa pral emèt fliyoresans.Lè rkwit, primè a ak pwofonde mare nan modèl la.Pandan etap ekstansyon an, polymerase a kontinyèlman sentèz nouvo chenn.ADN polymerase gen 5′-3′ aktivite eksonukleaz.Lè rive nan pwofonde, ADN polymerase a pral idrolize pwofonde a soti nan modèl la, separe gwoup la fliyoresan repòtè ak gwoup la fliyoresan quencher, epi lage siyal la fliyoresan.Depi gen yon relasyon youn-a-yon ant pwofonde a ak modèl la, metòd pwofonde a siperyè metòd koloran an tèm de presizyon ak sansiblite tès la.Metòd ankèt la se sitou itilize nan dyagnostik.

K: Ki sa ki kantite absoli?Ki sa ki se Relatif Quantification?

Repons: Kantifikasyon absoli refere a kalkil nimewo kopi inisyal echantiyon an yo dwe teste pa qPCR, tankou konbyen viris HBV ki nan 1ml san.Rezilta a jwenn nan quantification relatif se chanjman nan kantite jèn sib la nan yon echantiyon espesifik parapò ak yon lòt echantiyon referans, ak ekspresyon jèn yo kontwole oswa desann.

K: Èske kantite ekstraksyon RNA, efikasite transkripsyon ranvèse, ak efikasite anplifikasyon pral afekte rezilta eksperimantal yo?
K: Èske depo echantiyon, reyaktif ekstraksyon, reyaktif transkripsyon ranvèse, ak consommables limyè-transmèt afekte rezilta eksperimantal yo?
K: Ki metòd ki ka korije done eksperimantal yo?

Konsènan pwoblèm sa yo, nou pral dekri yo an detay nan seksyon avanse ak avanse anba a.
2. Konesans avanse

Konsènan PCR quantitative fliyoresan an tan reyèl, nou dwe rekonèt reyalite a ke dè milye de papye rechèch syantifik yo pibliye chak ane, nan mitan ki teknoloji PCR quantitative fluorescent se pa yon ti kantite.

Si pa gen okenn estanda komen pou mezire eksperyans fliyoresan PCR quantitative, rezilta yo ka varye anpil.Pou menm jèn nan menm espès yo, ak menm metòd pwosesis la, rezilta deteksyon yo pral varye anpil tou, epi li pral difisil pou moun ki an reta yo repete menm rezilta yo.Ou Pèsonn pa konnen kiyès ki bon ak kiyès ki mal.

Èske sa vle di ke fluoresan PCR quantitative se yon teknoloji tronpe oswa yon teknoloji enfidèl?Non, se paske fliyoresan PCR quantitative pi sansib ak pi egzak, ak yon ti kras move operasyon pral pwodwi rezilta konplètman opoze.Yon ti pèt se yon mil kilomèt lwen.Otè a nan atik la ka repete tòtire pa revizyon yo.An menm tan an, revize jounal la tou difisil pou chwazi nan diferan rezilta eksperimantal.

Tout moun nan tout, montre yon mank de konsansis nan eksperyans PCR an tan reyèl.Pou sa ka fèt, ansyen syantis nan endistri a te kòmanse fòmile estanda,mande pou kontribitè yo bay kèk detay eksperimantal ak tretman done ki nesesè (ki gen ladan done ki nesesè yo) nan atik la pou satisfè nòm sa yo.

Evalyatè yo ka jije kalite eksperyans nan lè yo li detay sa yo;lektè fiti yo kapab tou itilize sa a pou repete eksperyans la oswa amelyore eksperyans la.Lè sa a, rezilta eksperimantal yo jwenn nan fason sa a yo plen ak enfòmasyon, kalite siperyè, ak ka itilize.

MIBBI (Enfòmasyon minimòm pou envestigasyon byolojik ak byomedikal -http://www.mibbi.org) te vin fèt.MIBBI se yon pwojè ki bay estanda pou eksperyans.Li pibliye nan lanati.Pwojè sa a vize plizyè eksperyans byolojik, tankou byoloji selilè, Microarray, qPCR nou pral diskite kounye a, elatriye, epi li bay chak kalite eksperyans lè w ap soumèt maniskri.Enfòmasyon sa a ta dwe bay tout tan.

Nan pwojè MIBBI la, gen de atik ki gen rapò ak fluoresan PCR quantitative, sètadi:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) – yon langaj estriktire ak gid rapò pou done PCR an tan reyèl;
·MIQE (Enfòmasyon Minimòm pou Piblikasyon Eksperyans PCR an tan reyèl) – enfòmasyon minimòm pou pibliye atik sou eksperyans PCR an tan reyèl.
Premyèman, ann pale sou RDML, spesifikasyon nan tèminoloji.

Si pa gen okenn definisyon estanda pou tout bagay, li enposib kontinye diskisyon an, ki se poukisa eksplikasyon an nan tèm yo tèlman enpòtan nan egzamen an.
Tèminoloji yo itilize nan eksperyans fluoresan PCR quantitative a gen ladan kontni sa a.QIAGEN te fè pi bon rezime pou nou.Sa ki anba la yo tout sèkmachandiz .

Koub anplifikasyon
Koub anplifikasyon an refere a koub ki fèt pandan pwosesis PCR la, ak nimewo sik la kòm absis la ak entansite fliyoresan an tan reyèl pandan reyaksyon an kòm ordinate.

Yon koub anplifikasyon ekselan ta dwe gen karakteristik sa yo: debaz la plat oswa yon ti kras diminye, epi pa gen okenn tandans evidan anlè;pwen enfleksyon koub la klè, ak pant faz eksponansyèl la pwopòsyonèl ak efikasite anplifikasyon.Pi gwo pant lan, se pi wo efikasite anplifikasyon;koub anplifikasyon an jeneral Paralèl la bon, sa ki endike ke efikasite anplifikasyon chak tib sanble;faz eksponansyèl koub anplifikasyon echantiyon ki ba konsantrasyon evidan.

Debaz (debaz)
Debaz la se nivo bri nan sik la bonè, Anjeneral mezire ant 3yèm ak 15yèm sik la, paske ogmantasyon valè fluoresans ki te koze pa pwodwi anplifikasyon an pa ka detekte pandan peryòd sa a.Kantite sik yo itilize pou kalkile liy debaz la ka varye epi yo ka bezwen redwi si yo itilize gwo kantite modèl oswa si nivo ekspresyon jèn sib la wo.

Fikse liy debaz la mande pou gade done fluoresans ki soti nan koub anplifikasyon lineyè a.Liy debaz la fikse pou kwasans koub anplifikasyon an kòmanse ak yon nimewo sik ki pi gran pase nimewo anwo sik debaz la.Liy debaz yo dwe mete endividyèlman pou chak sekans sib.Valè fliyoresan mwayèn yo detekte nan sik bonè yo bezwen soustraksyon nan valè fliyoresan yo jwenn nan pwodwi yo anplifye.Dènye vèsyon yo nan divès kalite lojisyèl an tan reyèl PCR pèmèt optimize otomatik nan anviwònman debaz pou echantiyon endividyèl yo.

Pandan premye sik reyaksyon anplifikasyon PCR la, siyal fluoresans la pa chanje anpil.Apwoche yon liy dwat yo rele liy debaz la, men si nou gade ak anpil atansyon nan premye sik yo, nou wè ke nan liy debaz la se sa k ap pase nan foto ki anba a.

Background Background refere a
valè fluoresans ki pa espesifik nan reyaksyon an.Pou egzanp: ensifizan fliyoresans trempe;oswa yon gwo kantite modèl ADN doub-chèn akòz itilizasyon SYBR Green.Konpozan background nan siyal la matematikman retire pa algorithm lojisyèl an tan reyèl PCR.

Siyal repòtè
Siyal Reporter refere a siyal fliyoresan ki te pwodwi pa SYBR Green oswa sond sekans espesifik ki gen etikèt fluorescent pandan PCR an tan reyèl.

Siyal repòtè nòmalize (RN)
RN refere a entansite fluoresans lank repòtè a divize pa entansite fluoresans lank referans pasif mezire nan chak sik.

Dye referans pasif
Nan kèk PCR an tan reyèl,se ROX nan lank fliyoresan itilize kòm yon referans entèn nòmalize siyal la fliyoresan.Li korije pou varyasyon akòz pipèt ki pa kòrèk, pozisyon byen, ak fluctuations fliyoresans sou yon baz byen pa byen.

Papòt fluoresans lan (papòt)
te ajiste pi wo pase valè background ak siyifikativman pi ba pase valè plato koub anplifikasyon an.Li dwe kouche nan rejyon lineyè koub anplifikasyon an, ki reprezante seri log-lineyè deteksyon PCR la.Papòt yo ta dwe mete nan gade koub log-anplifikasyon an pou faz log-lineyè PCR la fasil pou idantifye.Si gen plizyè jèn sib nan Real-Time PCR, yo dwe fikse papòt la pou chak sib.Anjeneral, siyal fluoresans nan premye 15 sik reyaksyon PCR yo itilize kòm siyal background fliyoresan, ak papòt fluoresans la se 10 fwa devyasyon estanda nan siyal fluoresans nan premye 3 a 15 sik PCR, ak papòt fluoresans la mete nan faz eksponansyèl PCR anplifikasyon.An jeneral, chak enstriman gen papòt fliyoresans li yo mete anvan ou itilize.

Cycle Threshold (CT) oswa Crossing Point (CP)
Sik kote koub anplifikasyon an travèse papòt la (sa vle di, pwen kote deteksyon fliyoresans ogmante anpil).CT kapab yon fraksyon ak kantite modèl kòmanse ka kalkile.Valè CT a reprezante kantite sik ki gen eksperyans lè siyal fliyoresan nan chak tib reyaksyon PCR rive nan papòt fikse a.Gen yon relasyon lineyè ant valè CT chak modèl ak logaritm nimewo kopi inisyal modèl la,pi wo nimewo kopi inisyal la, pi piti valè CT a, ak vis vèrsa.Ou ka fè yon koub estanda lè w sèvi ak yon estanda ki gen nimewo inisyal kopi li te ye, kote absis la reprezante valè CT a, epi òdone a reprezante logaritm nimewo kopi inisyal la.Se poutèt sa, osi lontan ke valè CT echantiyon enkoni a jwenn, yo ka kalkile nimewo inisyal kopi echantiyon an nan koub estanda a.

ΔCT valè
ΔCT valè dekridiferans ki genyen ant jèn sib la ak valè CT korespondan endogenous referans jèn la, tankou yon jèn antretyen, epi yo itilize nòmalize kantite modèl yo itilize:
⇒ΔCT = CT (jèn sib) - CT (jèn referans andojèn)

ΔΔCT Valè
Valè ΔΔCT a dekri diferans ki genyen ant valè ΔΔCT an mwayèn nan yon echantiyon ki enterese (egzanp, selil stimulé) ak valè ΔΔCT an mwayèn nan yon echantiyon referans (egzanp, selil san stimulation).Echantiyon referans lan yo rele tou echantiyon kalibrasyon an epi tout lòt echantiyon yo nòmalize nan sa a pou quantifikasyon relatif:
⇒ΔΔCT = mwayèn ΔCT (echantiyon enterè) – mwayèn ΔCT (echantiyon referans)

Jèn referans andojèn (jenn referans andojèn)
Nivo ekspresyon jèn referans andojèn yo, tankou jèn nan kay (jenes nan kay), pa diferan ant echantiyon yo.Konpare valè CT jèn referans yo ak jèn sib la pèmèt nivo ekspresyon jèn sib la nòmalize ak kantite RNA antre oswa cDNA (gade seksyon an sou valè ΔCT pi wo a).

Jèn referans entèn kòrèk pouposib degradasyon RNA oswa prezans nan inibitè anzim nan echantiyon RNA, osi byen ke varyasyon nan kontni RNA, ranvèse transkripsyon efikasite, rekiperasyon asid nikleyik, ak manyen echantiyon.Pou chwazi jèn referans optimal (yo), nou modifye algorithm la pou pèmèt seleksyon li nan referans optimal depann sou anviwònman eksperimantal la.

Kontwòl entèn
Yon sekans kontwòl ki anplifye nan menm reyaksyon ak sekans sib la epi sonde ak yon pwofonde diferan (sa vle di, fè PCR duplex).Kontwòl entèn yo souvan itilize pou eskli anplifikasyon ki echwe, tankou lè sekans sib la pa detekte.
Egzanp Kalibrasyon
Yon echantiyon referans (pa egzanp, RNA pirifye ki soti nan yon liy selil oswa tisi) yo itilize nan quantifikasyon relatif pou konpare tout lòt echantiyon yo pou detèmine nivo ekspresyon relatif yon jèn.Echantiyon kalibrasyon an ka nenpòt echantiyon, men se nòmalman yon kontwòl (pa egzanp, yon echantiyon ki pa trete oswa yon echantiyon soti nan tan zewo nan eksperyans la).

Kontwòl pozitif
itilize reyaksyon kontwòl akkantite modèl li te ye.Kontwòl pozitif yo souvan itilize pou tcheke si yon seri primè oswa yon seri primè-sond ap travay byen epi si reyaksyon an tabli kòrèkteman.

Pa gen kontwòl modèl (NTC)
Yon reyaksyon kontwòl ki gen tout eleman ki nesesè nan reyaksyon anplifikasyon eksepte modèl la, ki anjeneral ranplase ak dlo.Itilizasyon NTC ka jwenn kontaminasyon ki te koze pa kontaminasyon reyaktif oswa ADN etranje, kidonk asire otantisite ak fyab done deteksyon yo.Anplifikasyon kontwòl NTC a endike kontaminasyon.

Pa gen kontwòl RT (NRT)
Pwosesis ekstraksyon RNA ka genyen rezidyèl ADN jenomik, ki trè danjere e ki koupab ki afekte kalite done ak lènmi natirèl qPCR, kidonk lè w ap desine eksperyans, li dwe fèt pou sèlman anplifye deteksyon RNA.Gen de fason, youn se konsepsyon primè atravè entron, lòt la se konplètman retire ADN, ki youn ki pi bon, ki pral diskite pita.Kontwòl NTR a se yon glas majik pou detekte polisyon ADN.Si gen anplifikasyon, sa vle di gen polisyon.

Estanda
Estanda yo se echantiyon konsantrasyon li te ye oswa nimewo kopi yo itilize pou konstwi yon koub estanda.Yo nan lòd yo asire estabilite nan estanda a, fragman nan jèn anjeneral klonaj nan plasmid la epi yo itilize kòm estanda a.

Koub estanda a
se anjeneral dilye nan omwen 5 gradyan konsantrasyon ak pwodwi estanda a dapre rapò a double, ak 5 pwen yo trase nan kowòdone yo nan valè CT ak nimewo kopi, ak pwen yo konekte yo fòme yon liy jenere yon koub estanda.Pou chak koub estanda, validite li yo bezwen tcheke.Valè pant lan tonbe ant -3.3 ak -3.8, epi chak konsantrasyon fèt an triple.Pwen ki diferan anpil de lòt pwen yo ta dwe jete.Valè CT echantiyon yo dwe teste a pote nan koub estanda a, epi yo ka kalkile nivo ekspresyon echantiyon yo dwe teste a.

Valè CT echantiyon yo dwe teste a pote nan koub estanda a, epi yo ka kalkile nimewo kopi inisyal echantiyon yo dwe teste a.

Efikasite ak pant
Pant koub estanda a reprezante efikasite PCR an tan reyèl.
·Yon pant nan -3.322 endike ke efikasite anplifikasyon PCR la se 1, oswa 100% efikas, ak kantite pwodwi PCR double nan chak sik.
·Yon pant mwens pase –3.322 (eg, –3.8) endike yon efikasite PCR.
·Yon pant ki pi gran pase –3.322 (egzanp, –3.0) endike ke efikasite PCR parèt pi gran pase 100%, ki se kirye, ki jan yon sik PCR ta ka jenere plis pase doub pwodwi anplifye a?Sitiyasyon sa a rive nan faz ki pa lineyè reyaksyon PCR la, se sa ki gen yon gwo kantite anplifikasyon ki pa espesifik.

koub k ap fonn
Apre anplifikasyon qPCR la fini, pwodwi PCR la chofe.Kòm tanperati a ap monte, pwodwi anplifikasyon doub-blon piti piti fonn, sa ki lakòz yon diminisyon nan entansite fliyoresans.Lè yo rive nan yon sèten tanperati (Tm), yon gwo kantite pwodwi ap fonn.Fliyoresans tonbe sevè.Diferan pwodwi PCR gen diferan valè Tm ak diferan tanperati k ap fonn, pou yo ka idantifye espesifik PCR la.

Koub k ap fonn (kob dérivés)
Se koub la k ap fonn sòti pou fòme yon kat jeyografik pik, ki ka plis entwisyon montre sitiyasyon an nan fragman pwodwi PCR.Depi tanperati k ap fonn lan se valè Tm fragman ADN la, yo ka jije kèk paramèt ki afekte valè Tm fragman ADN, tankou gwosè fragman, kontni GC, elatriye. Anjeneral, dapre prensip konsepsyon primè nou an,longè a nan pwodwi a anplifye se nan seri a nan 80-300bp, kidonk tanperati a k ​​ap fonn yo ta dwe ant 80 ° C ak 90 ° C.

Entèpretasyon koub k ap fonn lan: Si sèlman pik prensipal la parèt ant 80 ° C-90 ° C, sa vle di ke PCR a fliyoresan quantitative pafè;si pik prensipal la parèt ant 80 ° C-90 ° C ak pik divès parèt anba a 80 ° C, se dimer nan Jadendanfan fondamantalman konsidere.Ou ka eseye ogmante tanperati annealing pou rezoud li;si pik prensipal la parèt ant 80 ° C-90 ° C, ak pik la divès parèt ankò lè tanperati a leve, li fondamantalman konsidere ke gen kontaminasyon ADN, ak ADN bezwen yo dwe retire nan etap inisyal la nan eksperyans la.

Natirèlman, gen toujou kèk sitiyasyon nòmal, ki pral kraze youn pa youn anba a.
3. Konesans avanse

Pou fè qPCR, mwen dwe di MIQE,Enfòmasyon minimòmpou Piblikasyon nanKantitatifPCR an tan reyèlEksperyans - enfòmasyon minimòm pou pibliye atik sou PCR quantitative an tan reyèleksperyans.Yo nan lòd yo senplifye konpreyansyon tout moun, nou pral senplifye kontni an kle.

Ou ka chèche tèks orijinal MIQE sou Entènèt la, ak bagay ki pi enpòtan an se ke li stipule lalis verifikasyon done ki bezwen bay lè w ap pibliye yon atik .

Evalyatè yo ka jije kalite eksperyans nan lè yo li detay sa yo;lektè fiti yo kapab tou itilize sa a pou repete oswa amelyore eksperyans la.
Li enpòtan pou remake ke nan lis sa a, enpòtans chak lis make ak E oswa D respektivman.Sa sa vle di?E: enfòmasyon esansyèl (yo dwe soumèt);D: enfòmasyon dezirab (bay otank posib).

MIQE (1) — Konsepsyon eksperimantal
Anpil skolè ki fini defans yo apre yo fin fini etid gradye yo p ap konnen kijan pou yo desine yon eksperyans poukont yo, ouvri kaye yo, epi fè sa pwofesè a di yo pou yo fè.Kòm yon rezilta, konsepsyon eksperimantal la pa te solid, ak depatman editoryal magazin an te di ke yo te vle fè moute foto sa a ak foto sa a, se konsa yo te fè li nan yon etourdisman.Men ki jan kochon yo fèt!

Pi pre lakay ou, premye prensip eksperyans lan se detèminerigueur nan lojik eksperimantal la.Bagay ki pi fondamantal se konsepsyon eksperimantal la, ak bagay ki pi enpòtan sou konsepsyon eksperimantal la se ki jan yo mete echantiyon sib la, echantiyon referans (kontwòl), ak kantite repetisyon, pou done eksperimantal yo ka referans, konparab, ak konvenk.

Echantiyon sib larefere a echantiyon an ki mande pou nou detekte jèn sib la apre yon sèten tretman.Echantiyon referans lanse echantiyon an san okenn tretman, ki souvan refere yo kòm kalite sovaj nan byoloji.

Repwodwi eksperimantalyo trè enpòtan.Anjeneral, kantite replike konvenkan yo dwe plis pase twa.Li nesesè yo fè distenksyon ant sa ki replikasyon byolojik ak sa ki replikasyon teknik.

Replika byolojik: Menm eksperyans verifikasyon an fèt ak diferan materyèl (tan, plant, lo, plak reyaksyon).

Byolojik duplication
Ann pran tretman pestisid pwav kòm yon egzanp.Nou vle flite pestisid sou twa plant yo nan ABC, Lè sa a, twa plant yo nan ABC yo se twa replike byolojik, epi yo se menm eksperyans verifikasyon te pote soti ak diferan materyèl.Men, kòm yon eksperyans, yon kontwòl definitivman nesesè, kidonk nou ka flite youn nan branch yo nan plant A yo fòme yon gwoup eksperimantal nan plant A, epi yo pa flite lòt branch yo nan plant A yo fòme yon gwoup kontwòl.Fè menm bagay la pou B ak C.

Replike teknik (replik teknik): Li se yon eksperyans repete ki fèt pou fè pou evite erè ki te koze pa operasyon, ki se aktyèlman yon twou kopi enkli nan menm materyèl la.Tou de tretman ak kontwòl yo dwe gen kopi paramèt (minimòm twa) nan jèn sib la ak jèn referans entèn la.

Repetisyon teknik
Pran pwav la trete ak pestisid kòm yon egzanp ankò.Pou gwoup la eksperimantal nan plant A, nou te fè twa twou PCR nan 1, 2, ak 3 pou jèn sib li yo ak jèn referans entèn yo respektivman, konsa tankou pran mwayèn nan apre deteksyon an.Pou kontwòl plant A Gwoup yo tou trete nan menm fason an.Menm jan an tou, fè menm tretman an pou plant B ak C.Sa a se repetisyon teknik.

Li se vo sonje sasa ki antre nan estatistik yo se repetisyon byolojik la, ak repetisyon teknik la se teste si gen nenpòt fenomèn o aza nan pwosesis eksperimantal la, konsa tankou fè rezilta eksperimantal yo kredib, se sa ki, pou fè pou evite erè lè yo pran mwayèn yo jan nou souvan di.

Kontwòl negatif - NTC ak NRT
NTC (Pa gen okenn modèl kontwòl), yon kontwòl san yon modèl, yo itilize pou verifye si materyèl eksperimantal la kontamine.Anjeneral, dlo yo itilize kòm yon modèl.Si gen yon reyaksyon fliyoresan, li endike ke kontaminasyon asid nikleyik te fèt nan laboratwa a.

Polisyon sa yo soti nan: dlo enpurte, reyaktif ki pa kalifye ki gen ADN andojèn, polisyon Jadendanfan, polisyon ekipman laboratwa, polisyon ayewosòl, elatriye, bezwen sèvi ak RNase scavengers ak inhibiteurs RNase.Polisyon aerosol se pi difisil pou jwenn.Imajine laboratwa w la tankou smog, ak divès asid nikleyik sispann nan lè a.

NRT (Non-Reverse Transcriptase), kontwòl san transcription ranvèse, se RNA transkripsyon ki pa ranvèse kòm yon kontwòl negatif, ki se kontwòl rezidi gDNA.

Lè w ap fè ekspresyon jèn, yo detekte kantite RNA lè w detekte kantite cDNA apre transkripsyon ranvèse.Si gen rezidi gDNA lè RNA pirifye, li pral lakòz erè nan rezilta eksperimantal yo, paske rezilta aktyèl yo jwenn yo se gDNA ak cDNA.Nan nivo total, pa sèlman cDNA, gDNA bezwen konplètman retire pandan ekstraksyon RNA.

MIQE (2) — echantiyon enfòmasyon
Sa yo rele echantiyon enfòmasyon an vle di ke lè nou pibliye yon atik sou qPCR, nou dwe eksplike enfòmasyon echantiyon an klèman, ki se yon pati endispansab nan atik la.Menm jan an tou, lè nou trete echantiyon yo, nou dwe tou kontwole pwòp operasyon nou yo pou asire validite echantiyon yo.

Deskripsyon echantiyon an se sèlman yon rezilta, epi nou ta dwe peye plis atansyon sou materyèl yo pran pandan tout eksperyans la.

Seleksyon materyèl eksperimantal
Echantiyon san - chwazi san fre, pa plis pase 4 èdtan.Echantiyon selilè - chwazi kolekte selil fre nan yon peryòd kwasans wòdpòte.Tisi bèt—Chwazi tisi fre, k ap grandi ak kouray.Tisi Plant - Chwazi tisi fre, jèn.

Ou dwe remake gen yon mo kle nan kèk fraz sa yo: fre .
Pou echantiyon ki anwo yo, pi bon, pri-efikas, ak ki estab twous sou mache a se twous Foregene a, ki ka byen vit ak fasil ekstrè ADN yo ak RNA.

Blood DNA Mini Twous

Twous izolasyon RNA total selilè

Animal Total RNA izole Twous

Twous Izolasyon RNA Total Plant

Plant Total RNA Isolation Kit Plus

Twous Izolasyon ADN Plant

Depo nan materyèl eksperimantal
Anjeneral pale, nou pa rekòmande pou estoke echantiyon yo, si kondisyon yo pèmèt.Sepandan, gen anpil zanmi ki pa ka fè eksperyans imedyatman apre pran echantiyon, ak kèk menm bezwen pote tank nitwojèn likid nan jaden an pou pran echantiyon.

Pou sa a kalite zanmi k ap travay di, mwen ka sèlman di ke ou pa konprann consommables reyaktif.Koulye a, anpil konpayi reyaktif consommables pwodwi reyaktif ki ka estoke echantiyon RNA nan tanperati chanm, epi ou ka chwazi sèvi ak yo.Metòd depo konvansyonèl la se depo nitwojèn likid, lè l sèvi avèk yon ti tank nitwojèn likid ki fasil pou pote.Apre pote echantiyon an tounen nan laboratwa a, sere li nan yon frijidè -80 ° C.

Pou eksperyans ki enplike RNA, yo dwe swiv prensip sis mo yo:tanperati ki ba, pa gen anzim,epivit .

Konsèp tanperati ki ba fasil pou konprann;san anzim, RNase se tout kote nan mond lan nou ap viv nan (otreman ou ta yo te touye pa VIH), kidonk ki jan pou fè pou evite RNase lè fè eksperyans se yon konsèp trè enpòtan;vit,Pa gen okenn koun fu nan mond lan ki pa ka kase, sèlman vitès pa ka kase.

Se poutèt sa, nan yon sans, pi kout tan an ekstraksyon, pi bon an twous la.Poukisa fèForegeneKit yo mete aksan sou vitès, paske yo konnen li byen.

PS: Gen kèk ti fi fè eksperyans ak anpil atansyon, men yo pa bon tankou yon slam dunk apre plizyè ane nan travay.Yo santi Bondye enjis, li plenyen pou lòt moun, e yo chèche lavi.An reyalite, li pa t 'konprann li.Li pa t 'pwoteje RNA a byen, ak jwè a slam dunk te ajil.Lè li te fè eksperyans lan, li te panse ke li ta fini slam dunk la ak twa fwa, senk fwa ak de divizyon, men li te fè eksperyans la byen.

Remak: Pi dousman, plis chans pou envazyon RNase.Ki jan yo fòme tèt ou yo dwe vit?Pa gen okenn fason, jis pratike plis.

Pou eksperyans diferan ak echantiyon diferan, li toujou nesesè li plis literati epi chwazi yon metòd apwopriye pou pwosesis.Pou koleksyon echantiyon an ak pwosesis depo, MIQE mande pou yo ekri li byen klè nan papye a, pou revize yo ka revize fyab nan papye a, epi li se tou pratik pou jèn yo etoudi repete eksperyans ou.

Malgre ke eksperyans byolojik yo difisil, yo se-wo fen.Si ou pa fè atansyon, ou ka ranvèse mond lan.Pou egzanp, fè SARS nan yon kriz byochimik, oswa fè diri ibrid pou sove 1.3 milya moun.Foto ki anba a se yon eksperyans chimik, ou ta dwe konprann ki jan ou fyè de rechèch ou jis lè w gade aparans li tankou Dick.Bliye li, pa nwa li.

MIQE (3) - ekstraksyon asid nikleyik.
Ekstraksyon asid nikleik se yon gwo evènman, ak tout eksperyans biyoloji molekilè kòmanse ak ekstraksyon asid nikleik.Premye a tout, ann kopye kontni MIQE a sou ekstraksyon asid nikleyik.

Gade nan fòm sa a, ou pa ka rete sou sifas la.Fòm nan se yon dogm.Pou w ka yon elèv ki pi wo, ou dwe mande poukisa.Kontni esansyèl nan tablo sa a se: Pouswivpite, entegrite, konsistans, ak kantite ekstraksyon RNA .

Premye pati nanpwosesis oswa enstriman se etap ekstraksyon asid nikleyik la.Si ou itilize yon ekstraktè asid nikleik otomatik pou fè ekstraksyon (avanse, tanpri kontakte m pou achte), ou bezwen endike non modèl enstriman an.

Non kit la ak

ki twous yo te itilize pou detay chanjman yo, ki reyaktif espesyal yo te ajoute oswa ki operasyon espesyal yo te fè yo ta dwe eksplike klèman pou lòt moun ka fasilman repete eksperyans ou a.

Gen kèk moun ki ajoute kèk reyaktif espesyal lè yo ekstrè echantiyon espesyal, panse ke sa a se zam sekrè yo epi yo pa di lòt moun.Pandan ke yo kenbe li sekrè, yo menm tou yo pèdi opòtinite pou fè atik ou a briye.Ou pa bezwen entelijan, ou dwe gen plis onèt pase peyi Zhang fin vye granmoun nan rechèch syantifik, si ou vle entelijan, atik la pral fè ou estipid.

dwe sonje nimewo pwodwi nan twous lalè ou kòmande kit la epi ekri atik la.An jeneral, gen de nimewo sou twous la: Cat—nimewo katalòg (nimewo pwodwi, nimewo atik), Lo—nimewo loto pwodwi (Itilize pou endike ki pakèt pwodwi a soti).

Anplis de sa, nimewo CAS la souvan itilize lè kòmande reyaktif byochimik, epi mwen pral popilarize li ansanm.Nimewo CAS la se nimewo American Chemical Society bay chak nouvo medikaman chimik.Anjeneral, twa nimewo yo konekte pa yon priz.Nimewo CAS Rushui a: 7732-18-5.Pwodwi chimik yo souvan gen plizyè alyas, men nimewo CAS la inik.Lè w ap kòmande medikaman, ou ka tcheke nimewo CAS li an premye.

Pi pre lakay nou, poukisa nou dwe dekri bagay sa yo aklè?An reyalite, li se tou tcheke bon jan kalite a nan ekstraksyon RNA.Itilizasyon enstriman ak twous yo pral fè ekstraksyon RNA pi konsistan.Echèl ekstraksyon nan laboratwa òdinè pa gwo, epi li ka jwenn ak twous.

Detay yo nan tretman DNase oswa RNase
Pwoblèm ki enpòtan nan PCR quantitative fliyoresan se anpeche kontaminasyon ADN, epi pa fè eksperyans si gen kontaminasyon.Se poutèt sa, li enperatif pou endike pwosesis ou te itilize pou trete ADN la, yo nan lòd yo demontre ke ADN nan pwosesis eksperimantal la te konplètman epi konplètman retire.reprezante pa yon dyagram chematik.

Dyagram chema RNA ak ADN
An jeneral, metòd pou retire ADN se trete RNA ak DNase apre ekstraksyon.Sepandan, sa yo se metòd relativman ansyen.Twous ekstraksyon RNA komèsyal yo te kapab retire ADN pandan pwosesis ekstraksyon an san yo pa ajoute DNase.Pou egzanp, yon seri de twous soti nan Foregene.

Remak: Retire ADN pandan ekstraksyon RNA se yon nepe de bò trè danjere, ki pral pwolonje tan operasyon ekstraksyon RNA ak ogmante risk pou degradasyon RNA.Fondamantalman, li se yon komès-off ant sede RNA ak pite.

Anplis de sa, kantite DNase ajoute nan kolòn adsorption ki baze sou silica a piti anpil, epi yo dwe itilize DNase bon jan kalite pou reyalize efè a.Unoptimized DNase pa ka dijere byen vit ak konplètman.Sa a se yon tès nan nivo teknik komèsan an.Natirèlman, gen menm plis machann etranj ki fè grandizè ke ADN ka retire san DNase.Li ka di ke nenpòt moun ki vante ke ADN ka konplètman retire san DNase se yon vwayou.ADN se yon estrikti relativman ki estab, epi li pa ka siye jis nan pale ak ri.

Evalyasyon kontaminasyon
metòd evalyasyon: deteksyon elektwoforèz, 1% agarose, 6V / cm, 15min, chaje 1-3 ul

Analiz quantitative asid nikleik
anjeneral mezire lè l sèvi avèk yon espektwofotomèt UV.Kite m 'premye popilarize siyifikasyon twa valè OD260, OD280, ak OD230.
·OD260nm: Li se longèdonn absòpsyon nan pik absòpsyon ki pi wo nan asid nikleyik, ak pi bon valè mezire varye ant 0.1 ak 1.0.Si ou pa, delye oswa konsantre echantiyon an pou pote l nan ranje.
·OD280nm: Li se longèdonn absòpsyon nan pik absòpsyon ki pi wo nan pwoteyin ak sibstans fenolik.
·OD230nm: Li se longèdonn absòpsyon nan pik absòpsyon ki pi wo nan idrat kabòn.

Apre sa, ann pale sou wòl chak endikatè.Pou A260, li ka itilize pou mezire rannman asid nikleyik.Lè OD260 = 1, dsDNA = 50μg / ml, ssDNA = 37μg / ml, RNA = 40μg / ml.

Pou pite, nou bezwen gade nan rapò yo ke nou souvan wè: OD260/280 ak OD260/230.
·ADN pi bon kalite: OD260/280 apeprè egal a 1.8.Lè li pi gran pase 1.9, li endike ke gen polisyon RNA, epi lè li se mwens pase 1.6, li endike ke gen polisyon pwoteyin ak fenol.
·Pi RNA: 1.7
·OD260/230: Kit se ADN oswa RNA, valè referans la se 2.5.Lè li se mwens pase 2.0, li endike ke gen polisyon nan sik, sèl ak matyè òganik.

RNA entegrite

Li trè enpòtan pou mezire entegrite RNA.Anjeneral, li nesesè pou fè yon eksperyans jèl denaturasyon RNA pou tcheke si klète ant 28S ak 18S RNA se yon relasyon de pliye.Lè twazyèm gwoup 5S la parèt, sa vle di ke RNA a te kòmanse degrade, eksepte pou envètebre.

Done pou evalyasyon kalite RNA: Anplis tès ki anwo yo, genyen tou kèk tès enstriman ki pi avanse an tèm de entegrite RNA, tankou tès entegrite RQI nan sistèm elektwoforèz otomatik Experion, ki ka detekte si RNA degrade envizib.

Nan rechèch syantifik, PCR quantitative fluorescent se yon konparezon ant jèn sib la ak jèn referans entèn la.Se poutèt sa, nan pwosesis la nan prezèvasyon echantiyon RNA, ekstraksyon RNA, elatriye, objektif prensipal la se asire entegrite nan RNA.

Ki jan entegrite RNA afekte balans ki genyen ant jèn sib la ak jèn referans entèn la ka byen fasil konprann nan figi ki anba a.Degradasyon ap mennen nan enkonplè jèn, si li se enkonplè nan jèn referans entèn la oswa enkonplè nan jèn nan sib, li pral gen yon gwo enpak sou done yo.

Dyagram chema jèn sib ak jèn referans, pa dwe vre

Tès anpèchman (si wi ou non valè CT a siprime anba konsantrasyon wo oswa ba oswa lòt kondisyon)

Lè w pran figi sa a kòm yon egzanp, valè Ct senk koub yo se jan sa a.Distribisyon valè CT ant koub yo se inegal, ak valè Ct yo retade anba konsantrasyon wo ak ba, ki se ka anpèchman PCR.

Pwen kle: Nan pwosesis la nan ekstraksyon RNA, nou bezwen abandone move konsepsyon ak etabli sa ki kòrèk.

Lide a move se: ekstraksyon RNA sèlman pouswiv sede a, panse ke pi gwo kantite lajan an nan RNA jwenn, pi bon an.An reyalite, lè nou fè quantification, si kantite jèn yo pa gwo anpil, nou pa bezwen anpil RNA.Kantite RNA ou ekstrè an plis pase ase.

Konsèp ki kòrèk la se:Ekstraksyon RNA ta dwe pouswiv pite, entegrite ak konsistans.Pite ka asire ke transcription ranvèse ki vin apre a pa anpeche ak done yo pa pral afekte pa ADN.Entegrite asire balans nan sekans sib ak referans entèn yo.Konsistans asire chaje echantiyon ki estab.

MIQE (4) – ranvèse transcription
Move konsepsyon: pouswit pi wo volim echantiyon.
Konsèp kòrèk: Pouswiv konsistans (estabilite), kèlkeswa kantite RNA chaje, efikasite transkripsyon ranvèse rete konsistan, asire ke diferans ki genyen nan cDNA ka vrèman reflete diferans ki genyen nan mRNA.
Nou eksplike pwosesis sa a ak yon dyagram chema:

Dyagram chema nan efikasite transcription ranvèse, pa dwe vre
Premye a tout, nou bezwen konprann diferans ki genyen ant pwosesis transkripsyon ranvèse ak pwosesis PCR la.PCR sibi plizyè pwosesis chofaj ak rkwit, ak fragman sib la ap grandi yon fason eksponansyèl;pandan ke transkripsyon ranvèse pa gen pwosesis sa a, nou ka imajine ke transcription ranvèse se aktyèlman youn a youn Pandan pwosesis replikasyon an, kòm anpil moso nan RNA

jan gen ka jwenn anpil moso nan cDNA Enfòmasyon, li ta dwe konprann kounye a, paske fragman gwo ak ti yo te ranvèse-transkri, epi li enposib konsantre sou yon fragman.Epi paske kantite RNA relativman piti, kantite cDNA jwenn tou relativman ti, kontrèman ak PCR, ki gen yon efè anplifikasyon, kidonk li se fondamantalman enposib pou detekte.

Rezilta elektwoforèz cDNA
Dezyèmman, depreferans, transkripsyon ranvèse fèt youn-a-yon sèl, men pa gen okenn transkriptaz ranvèse nan nenpòt konpayi ki ka reyalize efè sa a.Fondamantalman, efikasite pifò transkriptaz ranvèse sega ant 30-50%.Si sa a se ka a, nou ta pito gen yon efikasite transkripsyon ranvèse relativman ki estab, ki se sa nou vle wè nan figi a: 3 RNAs jwenn 2 cDNAs, 6 RNAs jwenn 4 cDNAs, kidonk pa gen pwoblèm konbyen echantiyon yo chaje, efikasite transcription ranvèse a se relativman ki estab.Nou pa vle wè sitiyasyon an kote ranvèse transkripsyon efikasite se enstab ak gwo konsantrasyon inibit.

Se konsa, ki jan yo verifye si efikasite nan transcription ranvèse se ki estab?Metòd la trè senp, ou sèlman bezwen fè yon tès konparezon: youn se ranvèse transkripsyon nan cDNA apre double dilution nan RNA, ak lòt la se fè double dilution apre ranvèse transkripsyon nan cDNA, ak Lè sa a, fè qPCR yo wè pant lan jwenn Èske li konsistan.Kòm yon elèv ki pi wo, ou ta dwe konprann li nan kèk segonn.Jan yo montre anba a:

Dilution RNA ak cDNA pou teste si efikasite transkripsyon ranvèse estab
Ranvèse transkriptaz ak twous
Ki jan pafè fluorescent quantitative PCR gen ekselan transkriptaz ranvèse ak twous.Transkriptaz ranvèse se apeprè divize an de kalite dapre sous la, AMV oswaM-MLV, ak pèfòmans yo se menm jan ak sa yo montre nan tablo a.

Aktivite RNase H
RNase H se Ribonuclease H, non Chinwa a se ribonuclease H, ki se yon andorinukleaz ki ka espesyalman idrolize RNA nan chèn ibrid ADN-RNA.RNase H pa ka idrolize lyezon fosfodiestè yo nan ADN oswa RNA yon sèl oswa doub, se sa ki pa ka dijere ADN oswa RNA yon sèl oswa doub.Souvan yo itilize nan sentèz dezyèm strand nan cDNA.

Se yon bagay etranj.Nou di ke transkriptaz ranvèse gen aktivite RNase H, pa ke transkriptaz ranvèse gen RNase H, epi li ka pa posib pou separe RNase H ak transkriptaz ranvèse, petèt akòz konfòmasyon nan sèten gwoup nan transkriptaz ranvèse Aktivite sa a se ki te koze pa transkriptaz ranvèse a.

Se poutèt sa, kèlkeswa efikasite transkripsyon ranvèse ki pi wo nan AMV, aktivite RNase H li yo diminye sede cDNA.Natirèlman, manifaktirè reyaktif yo toujou ap optimize pwodwi yo pou elimine aktivite RNase H nan transkriptaz ranvèse otank posib pou ogmante pwodiksyon cDNA.
Tanperati rkwit

Estrikti segondè nan RNA nan diferan tanperati
Gade figi ki anwo a pou estrikti segondè RNA nan diferan tanperati, epi sèvi ak zouti sou entènèt mFold pou detèmine estrikti segondè fragman sib la nan kondisyon espesifik tanperati ak konsantrasyon sèl.Nan 55 ° C, estrikti segondè nan RNA a se toujou trè konplèks, transkriptaz ranvèse pa ka travay, ak estrikti segondè a pa ka konplètman rezoud jiskaske 65 ° C, pandan y ap tanperati a pi gwo nan AMV ak M-MLV se byen lwen pi ba pase tanperati sa a.
Kisa pou fe?Estrikti segondè a se pè konplemantè nan modèl la tèt li, ki mennen nan konpetisyon fò ant Jadendanfan an ak transkriptaz ranvèse ak modèl la, sa ki lakòz yon seri de pwoblèm tankou ba E ak pòv repetibilite.

Kisa pou fe?Sèlman ogmante tanperati rkwit la otank posib.

Anpil manifaktirè reyaktif yo ap amelyore transkriptaz ranvèse yo atravè jeni jenetik.Gen kèk ogmante tanperati reyaksyon an, tankou Jifan ak Aidelai, ak kèk retire gwoup aktif RNase H anzim pou amelyore afinite ant anzim ak modèl RNA a.Segondè afinite ka konpetitivman peze estrikti segondè a epi li san pwoblèm, epi tou amelyore anpil efikasite nan transcription ranvèse.
Pwen kle: Ranvèse transcription se pi enpòtan pou pouswiv konsistans ranvèse transkripsyon efikasite (anzim pa dwe sèlman efikas men tou ki estab), olye ke kantite echantiyon chaje, si se pa yon PCR quantitative fluorescent patikilyèman gwo-echèl, li pa pral posib nan tout.Plizyè cDNA.
Manifaktirè divès te fè tou kèk efò nan pouswit konsistans.Pa egzanp, pifò konpayi yo gen kounye a pake ranvèse transcription kòm yon twous estanda pou vann, ki se yon bon chwa.
Pou egzanp, twous RT Easy Series Foregene a:

RT Easy I (Mèt premix pou premye twous sentèz cDNA)

MIQE (5) - enfòmasyon jèn sib

Figi ki anwo a eksplike
1. Si jèn sa a efikas pou eksperyans repete ka jeneralman verifye pa eksperyans repete.
2. Gene ID, ou konnen.
3. Longè jèn, longè total jèn sib la se definitivman pa gen okenn pwoblèm.Lè w ap desine primè, asire longè anplikon an ant 80-200bp pou asire yon pi bon efikasite anplifikasyon.
4. Sekans eksplozyon enfòmasyon konparezon, jèn sib la bezwen konpare nan genebank pou anpeche anplifikasyon ki pa espesifik.
5. Prezans pseudogenes.Yon pseudogene se yon sekans ADN ki sanble ak yon jèn nòmal men li pèdi fonksyon nòmal li.Li souvan egziste nan fanmi milti-jèn nan ekaryot.Anjeneral li reprezante pa ψ.Li se yon kopi ADN jenomik ki pa fonksyonèl nan genomic a ki sanble anpil ak sekans jèn kodaj la., yo jeneralman pa transkri, epi yo pa gen okenn siyifikasyon klè fizyolojik.
6. Pozisyon primè yo parapò ak ekson ak entron.Nan kòmansman ane yo, lè nou te rezoud pwoblèm kontaminasyon ADN, nou souvan te peye atansyon sou pozisyon primè, ekson, ak entron, epi jeneralman nou konsidere konsepsyon primè atravè entron pou evite anplifikasyon ADN.Tanpri gade figi ki anba a: nwa reprezante entron, divès kalite ble reprezante ekson, woz reprezante primè komen, ak wouj klere reprezante primè entron.

Chema, pa janm vre
Ki sa ki yon plan pafè sa a sanble, men an reyalite, nan pifò ka yo, primè trans-intron yo pa tankou majik kòm imajine, epi yo pral lakòz tou anplifikasyon ki pa espesifik.Kidonk, pi bon fason pou anpeche kontaminasyon ADN se retire ADN nèt.
7. Prediksyon konfòmasyon.Sèvi ak egzanp sa a ankò, sèvi ak zouti sou entènèt mFold la pou detèmine estrikti segondè fragman sib la nan yon tanperati espesifik ak konsantrasyon sèl.

Estrikti segondè nan RNA nan diferan tanperati
Estrikti segondè a se koupi konplemantè nan modèl la tèt li, ki pral mennen nan konpetisyon fò ant Jadendanfan ak modèl appariement, ak chans yo nan primè obligatwa yo mwens, sa ki lakòz yon seri de pwoblèm tankou E ki ba ak repetibilite pòv.Atravè prediksyon lojisyèl, si pa gen okenn pwoblèm estrikti segondè, sa ta bon.Si genyen, atik swivi nou an pral espesyalman diskite sou fason pou rezoud pwoblèm sa a.

MIQE (6) - qPCR Oligonukleotid

Pou PCR quantitative fliyoresan, premye bagay ou lite ak chak jou se ekstraksyon RNA, ak dezyèm bagay la ka konsepsyon primè.
Premye a tout, nou toujou tcheke règ yo sou konsepsyon Jadendanfan dapre lis verifikasyon MIQE la.Li tèlman senp ke scumbags yo ka ri, epi nou ka fini li nan yon fraz: chèche konnen sekans ak pozisyon nan pwofonde nan jadendanfan ak metòd modifikasyon an.Pou metòd pou pirifye Jadendanfan, sentèz Jadendanfan se konsa bon mache kounye a, qPCR se merite pou PAGE ak metòd pirifikasyon pi wo a, ak enfòmasyon an nan enstriman an sentèz pa enpòtan.Anpil moun te fè primè pou dè dekad epi yo pa konnen ke sentèz la se ABI3900.
Konsènan prensip konsepsyon Jadendanfan, ou pa bezwen memorize yo pa rote, paske pifò lojisyèl konsepsyon Jadendanfan oswa zouti sou entènèt ka pran swen pwoblèm sa yo (rekòmande zouti sou entènèt primer3.ut.ee/), ak 99.999% nan konsepsyon Jadendanfan pa fè manyèlman.
Jis tcheke pwen sa yo apre yo fin fèt primè yo:
1. Konsepsyon primè tou pre fen 3': Nan ka itilize oligo dT primè pou sentèz premye strand cDNA, konsidere efikasite transcription ranvèse ak entegrite RNA, primè ki fèt yo bezwen fèt tou pre fen 3' pou amelyore efikasite anplifikasyon.Sèvi ak yon foto pou eksplike jan sa a (pa gen okenn fason pou konprann sa a):

Poukisa premye yo ta dwe fèt tou pre fen 3′, li pa dwe vre
2. Valè TM: Valè Tm se nan 55-65 ° C (paske aktivite exonuclease la pi wo nan 60 ° C), ak kontni an GC se nan 40% -60%.
3. BLAST: Pou evite anplifikasyon ki pa espesifik nan genòm nan, yo dwe itilize Blast pou verifikasyon siplemantè.

MIQE (7) — pwosesis qPCR

1. kit qPCR
Dapre kondisyon ki nan MIQE, nou dwe dekri klèman kondisyon yo reyaksyon konplè nan atik la, ki gen ladan konfigirasyon an nan sistèm nan reyaksyon PCR, ki twous yo itilize, ki moun ki se manifakti a, ki jan gwo se sistèm nan reyaksyon, si metòd la lank oswa metòd la pwofonde yo itilize, anviwònman pwogram PCR.Chofè veteran yo pral definitivman jwenn ke osi lontan ke yo chwazi twous la, se enfòmasyon ki anwo yo fondamantalman detèmine.
Kounye a, fabrike ak pwodiksyon de twous PCR fliyoresan se yon teknoloji ki gen anpil matirite.Osi lontan ke ou pa chwazi manifaktirè trè move, pwobabilite pou pwoblèm yo pa wo, men nou toujou vle pataje avèk ou kèk pwen:
Anzim Taq ki kòmanse cho:Pati ki pi enpòtan nan PCR se anzim Taq ki kòmanse cho.Anzim yo cho-kòmanse sou mache a jeneralman divize an de kalite, youn se yon chimik modifye anzim cho-kòmanse (ou ka imajine li kòm embedding parafine), ak lòt la se se yon anzim cho-kòmanse pou modifikasyon antikò (antijèn-antikò obligatwa).Modifikasyon chimik se yon fason byen bonè nan anzim cho-kòmanse.Lè yo rive nan yon sèten tanperati, anzim la pral lage aktivite li yo.Antikò-modifye anzim cho kòmanse itilize metòd byolojik pou bloke aktivite anzim la.Lè yo rive nan yon sèten tanperati, antikò a pral denatire ak inaktive kòm yon pwoteyin, epi aktivite anzim yo pral antre nan jwèt.

Sepandan, ki sa ki sèvi ak sa a?Sa a se ka a, aktivite a lage nan anzim modifye antikò se pi vit pase anzim modifye chimik, kidonk an tèm de sansiblite, anzim modifye antikò gen yon ti avantaj, se konsa ke gen fondamantalman pa gen okenn anzim chimik modifye nan twous yo sou mache a.Si genyen, Lè sa a, teknoloji manifakti sa a toujou kole nan epòk milenè a.
Konsantrasyon ion mayezyòm:Konsantrasyon ion mayezyòm trè enpòtan nan reyaksyon PCR la.Konsantrasyon iyon mayezyòm apwopriye ka ankouraje liberasyon aktivite anzim Taq.Si konsantrasyon an twò ba, aktivite anzim yo pral siyifikativman redwi;si konsantrasyon an twò wo, anplifikasyon ki pa espesifik ki katalize anzim yo pral amelyore.Konsantrasyon an nan iyon mayezyòm pral afekte tou rkwir nan primè, tanperati a k ​​ap fonn nan modèl la ak pwodwi PCR, kidonk afekte sede a nan fragman anplifye.Se konsantrasyon nan iyon mayezyòm jeneralman kontwole nan 25mM.Natirèlman, pou yon twous bon, konsantrasyon nan iyon mayezyòm dwe byen kontwole.Gen kèk machann ajoute yon ajan chelating ion mayezyòm nan reyaktif la, sa ki ka reyalize efè ajisteman otomatik nan konsantrasyon ion mayezyòm.
Konsantrasyon lank fliyoresan:Lank fliyoresan, ki se SYBR Green nou itilize anjeneral, sitou jenere fliyoresans pa obligatwa nan ti Groove nan ADN doub-bloke, paske obligatwa nan lank lan nan ADN doub-bloke se pa espesifik, sa vle di Osi lontan ke ADN doub-bloke konbine avèk li, fliyoresans ka rive, se konsa Jadendanfan-dimè yo pral konbine siyal background nan sistèm nan yon modèl ADN.
PS: Akòz pwopriyete limyè-sansib li yo, pwodwi sou mache a jeneralman pake nan tib santrifij mawon opak (jan yo montre nan foto ki anba a).Sepandan, sa a pral rankontre yon pwoblèm.Li difisil pou wè si likid la aspire lè w pran echantiyon.Nan respè sa a, Qingke se tout bon itilizatè ki pi zanmitay (jan yo montre nan foto ki anba a), epi tib transparan an pake nan yon sak fèblan opak.Lè sa a, mete l 'nan yon sache fèblan, pran an kont konvenyans nan evite limyè ak echantiyon.Ou dwe chwazi nimewo bon pwodwi.TSE204 se yon egzistans super pri-efikas, ki fè m 'vle plante zèb.

Konsantrasyon an nan lank fliyoresan an trè enpòtan tou.Si konsantrasyon an twò ba, koub anplifikasyon an pa pral moute nan etap la pita epi li pa pafè;si konsantrasyon an twò wo, li pral lakòz entèferans bri.Depi fliyoresan PCR quantitative a depann sitou sou valè CT a, si konsantrasyon nan lank fliyoresan an pa ajiste byen, pwen ki ba a pi bon pase pwen segondè a.Natirèlman, konsantrasyon nan lank apwopriye se pi bon an.

ROX: koloran ROX yo itilize pou korije erè siyal fliyoresan byen-a-byen.Gen kèk manifaktirè enstriman ki mande kalibrasyon, pandan ke lòt moun pa fè sa.Pou egzanp, itilizasyon enstriman anplifikasyon PCR an tan reyèl Thermo Fisher Scientific a anjeneral mande pou kalibrasyon, tankou 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, elatriye. Enstriksyon jeneral twous yo pral dekri li.
Foregene a qPCR Mix tou gen lank ROX, ki se pratik pou itilize nan divès modèl.

Tan reyèl PCR Kit-Taqman

Tretman kosyon idwojèn fèb: Tretman lyezon idwojèn fèb se yon pwoblèm relativman teknik.Pa gen anyen ki te li manyèl yo nan anpil twous, men okenn nan yo pa mansyone sijè sa a.An reyalite, li tèlman enpòtan.Konbinezon an nan baz sitou depann sou fòs nan lyezon idwojèn.Lyezon idwojèn fò yo se anplifikasyon nòmal, ak lyezon idwojèn fèb mennen nan anplifikasyon ki pa espesifik.Si lyezon idwojèn fèb pa ka elimine byen, anplifikasyon ki pa espesifik pa ka evite.Nan sijè ki abòde lan otè a, sèlman kèk konpayi yo te remake pwoblèm sa a.Lè ou achte twous la, ou ka refere a si wi ou non ou te konsidere yon solisyon nan sans sa a pou twous la ou vle chwazi.

Volim reyaksyon: Se sistèm nan 20-50ul pi souvan itilize, ak pi piti volim gen chans rive nan lakòz erè.An jeneral, enstriksyon twous yo pral rekòmande pou itilize volim reyaksyon PCR yo.Pa entelijan epi sèvi ak pi piti volim pou ekonomize depans yo.objektif la nan.Volim rekòmande pa machann yo aktyèlman te teste, epi li ka ke yo pa ka rezoud pwoblèm nan nan erè ki te koze pa ti komèsan.
2. Manifakti a ak nimewo atik plak la tib
Tout moun konnen prensip fluoresan PCR quantitative.Koleksyon fliyoresan se sitou te pote soti nan bouchon tib PCR.Lè w ap chwazi PCR consommables, peye atansyon sou de pwen: bon transmisyon limyè ak apwopriye pou enstriman an.Anjeneral pale, ankadreman yo ak tib nan mak endikap yo amann, men ou dwe chwazi ak anpil atansyon an tèm de adaptasyon, otreman ou pa yo pral kapab sèvi ak enstriman an.

4. Top nivo konesans

MIQE (8) — validation qPCR
Sa a se pi gwo priyorite nan qPCR!Se konsa, anpil ewo te tonbe nan sab la isit la.Natirèlman, li posib tou ke ou gen chans ak jèn yo ou etidye yo senp, kidonk ou te flote nan gwòt glas la ansanm van an.Enfòmasyon verifikasyon qPCR la gen entansyon teste fyab done yo.Nou bay enfòmasyon pou verifikasyon ki nesesè yo jan sa a:

1.Tès spesifik
Espesifik anplifikasyon jèn sib la teste lè w tcheke si foto elektwoforèz la se yon gwoup sèl;verifikasyon sekans;koub k ap fonn pou wè si kat jeyografik pik la se sèl;verifikasyon dijesyon anzim ak lòt metòd.
Isit la, nou konsantre sou tli analiz de anplifikasyon ki pa espesifik lè l sèvi avèk metòd la nan koub k ap fonn.Anjeneral pale, lè nou konsepsyon primè, gwosè fragman pwodwi a oblije nan seri 80-200bp, ki fè tanperati k ap fonn pwodwi PCR 80-85 °C.Se poutèt sa, si gen pik divès, dwe gen lòt pwodwi anplifikasyon ki pa espesifik;si pik la parèt anba a 80 ° C, li jeneralman konsidere kòm yon dimè Jadendanfan;si pik la parèt pi wo a 85 ° C, jeneralman konsidere kòm kontaminasyon ADN oswa plis anplifikasyon non espesifik nan fragman gwo.
Remak: Pafwa gen sèlman yon sèl pik nan 80 ° C.Nan moman sa a, konsèp sa a dwe respekte.Li posib ke rezilta anplifikasyon yo se tout dimè primè.

Koub k ap fonn nòmal (sèl pik ki pa gen anplifikasyon ki pa espesifik)

Koub k ap fonn pwoblèm (anplifikasyon ki pa espesifik nan pik esprik)
【Analiz ka】

Gen yon pik prensipal, men dimer nan Jadendanfan se grav
Koub k ap fonn yon sèl-pik nan figi ki anba a ka fasilman twonpe je ou, panse li se yon eksperyans pafè, men rezilta a se konplètman mal.Nan moman sa a, nou dwe gade tanperati a k ​​ap fonn.Tanperati pik la se pi ba pase 80 ° C, ki se konplètman primè-dimer.

Pa gen fragman sib, tout dimers Jadendanfan
Isit la, frè m 'pa ka sispann.Foto ki anba la a se yon foto ki te pran ak yon telefòn mobil ke yon kochon voye ban mwen.Reyaktif yo li te itilize yo se tout mak ki souvan itilize nan endistri a.Li te chanje soti nan yon mak T-prefiks nan yon lòt mak T-prefiks.Mwen panse ke ou te deja devine li.Bagay la rele m ': "Reyaktif yo itilize nan premye foto a twò bon, ak pik la se sèl.Pita, apre w fin itilize reyaktif ou rekòmande a, li vin tankou dezyèm foto a, ak pik melanje.Ou rann mwen mizerab."
Separe de graf yo.Nan premye gade, youn gen yon sèl pik, ak lòt la gen yon pik doub.Nonsense, yon sèl pik se nan kou amann.Eske se vre?
Pi mal pase Dou E, si mwen mete de foto yo nan foto ki anba a, ou pral konprann imedyatman.An reyalite, nou fasil paralize pa sa a kalite foto.Apre analiz atansyon, nou te jwenn ke: pikwa nan premye figi a se nan 75 ° C, ki se konplètman Jadendanfan dimer;pikwa nan dezyèm figi a parèt nan 75 ° C ak 82 ° C, omwen gen pwodwi a parèt.

Foto fidbak nan men elèv yo
Se konsa, pwoblèm nan fondamantal se pa pwoblèm nan nan reyaktif, men pwoblèm nan nan konsepsyon Jadendanfan.An menm tan an, li tou pwouve ke kèk gwo mak yo pa nan bon jan kalite fè, epi li tou pwouve sa frè m 'te di anvan: Se pa mak la reyaktif ki sipòte atik ou a.Li se atik ou a ki soutni mak la nan reyaktif.Jis imajine, si scumbag la pa t 'chanje reyaktif yo, done yo mal yo ta voye nan jounal la, ak sa ki ta rive ta dwe yon trajedi.
2. Valè Ct nan kontwòl vid
Pa eksplike, si kontwòl vid la gen yon valè Ct, èske se pa polisyon?Sepandan, ou toujou bezwen konprann ki kontwòl vid ki gen yon valè Ct.Si se NTC, sa vle di ke gen ADN etranje tankou kontaminasyon reyaktif.Si se NRT, sa vle di ke RNA ekstrè a gen kontaminasyon ADN.
3. koub estanda
Ki gen ladan fòmil pant lan ak kalkil, efikasite PCR la ka kalkile atravè fòmil la.Yon eksperyans pafè mande pou pant koub estanda a apwoche 3.32, ak R² apwoche 0.9999.
4. lineyè ranje dinamik
Ranje dinamik reyaksyon an se lineyè.Dapre modèl la itilize pou jenere koub estanda a, ranje dinamik la ta dwe gen ladan omwen 5 gradyan konsantrasyon, epi peye atansyon sou chanjman nan valè Ct nan gradyan konsantrasyon segondè ak gradyan konsantrasyon ki ba.
5. Deteksyon presizyon
Chanjman nan rezilta qPCR, se sa ki, pòv repetibilite, se sa ki, pòv presizyon, ki te koze pa anpil faktè, ki gen ladan tanperati, konsantrasyon, ak operasyon.Precision qPCR jeneralman vin mwens kontwole kòm kantite kopi diminye.Idealman nan varyasyon eksperimantal, varyasyon teknik sa a ta dwe diferan de varyasyon byolojik, ak replike byolojik ka dirèkteman adrese diferans estatistik nan rezilta qPCR ant gwoup oswa tretman.An patikilye pou tès dyagnostik yo, yo dwe rapòte pi bon presizyon ant tès (repetibilite) atravè sit ak operatè yo.
6. Deteksyon efikasite ak LOD (nan multiplex qPCR)
LOD se konsantrasyon ki pi ba nan 95% echantiyon pozitif yo detekte.Nan lòt mo, konsantrasyon nan LOD ki genyen nan yon seri repwodwi jèn sib pa ta dwe depase 5% nan reyaksyon yo echwe.Lè w ap fè analiz qPCR multiplex, espesyalman pou deteksyon similtane nan mitasyon pwen oswa polimorfism, qPCR multiplex bezwen bay prèv ke presizyon nan fragman sib miltip pa konpwomèt nan tib la menm, deteksyon miltip ak deteksyon tib sèl Efikasite ak LOD yo ta dwe menm bagay la.Espesyalman lè jèn sib konsantrasyon wo ak jèn sib konsantrasyon ba yo anplifye ansanm, yo dwe peye atansyon sou pwoblèm sa a.
Pwoblèm ak solisyonAnjeneral pale, pwoblèm yo souvan rankontre nan debogaj qPCR konsantre sou aspè sa yo:
· anplifikasyon ki pa espesifik
·Difikilte chwa nan konsantrasyon Jadendanfan ak pwoblèm ak Jadendanfan-dimers
· Tanperati a recuit pa kòrèk
·Estrikti segondè afekte efikasite anplifikasyon
anplifikasyon ki pa espesifik
anplifikasyon ki pa espesifikrive, li jeneralman konsidere si konsepsyon Jadendanfan an pa apwopriye, men si ou pa prese chanje primè yo, ou ka eseye metòd sa yo an premye (se prensip la tou tache):
·Ogmante tanperati a annealing - eseye fè lyezon idwojèn fèb pa kapab kenbe;
·Ranse tan annealing ak elongasyon - diminye chans pou lyezon idwojèn fèb;
· Diminye konsantrasyon primè – diminye chans pou yo mare primè redondants ak rejyon ki pa sib yo;
Ba efikasite anplifikasyon
Sitiyasyon an opoze ak anplifikasyon ki pa espesifik - efikasite anplifikasyon ki ba, ak mezi yo fè fas ak efikasite anplifikasyon ki ba yo se jis opoze a:
· Pwolonje tan an recuit ak elongasyon;
· Chanje nan PCR twa etap epi redwi tanperati rkwir la;
·Ogmante konsantrasyon primè a;
Ps: Anpil elèv gradye ki fèt nan ane 90 yo pa vle etidye ki jan yo debug eksperyans, epi espere ke twous la ka konplètman rezoud pwoblèm nan (si ou vle ale nan yon konpayi reyaktif fè rechèch ak devlopman apre gradyasyon), an reyalite, manifaktirè yo reyaktif panse tou nan fason sa a, mwen espere ke li se yon moun fou. faktè absòpsyon kosyon.Pou fasil rezoud pwoblèm nan, moun san konprann toujou gen pou li entwodiksyon konpayi réactif pou wè si gen yon faktè ki absòbe lyezon idwojèn fèb.
Difisil chwa nan konsantrasyon Jadendanfan ak pwoblèm ak Jadendanfan-dimers
Metòd 1: Anjeneral pale, enstriksyon twous yo pou qPCR gen sistèm rekòmande ak konsantrasyon primè rekòmande.
Metòd 2: Debogaj pa mete gradyan konsantrasyon Jadendanfan an.Yo vòlè foto ki anba a nan men yon konpayi pou ilistre.Figi ki anba a montre rezilta quantitative fluoresans ki fèt ak twa gradyan konsantrasyon primè (100nM, 250nM, 500nM) ak kat gradyan konsantrasyon modèl (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng).Valè Ct rezilta eksperimantal yo trase jan sa a:

Seleksyon Primè Konsantrasyon Konkatène chak konsantrasyon primè nan yon liy jan sa a:

Chwa a nan konsantrasyon Jadendanfan se evidan, relasyon an lineyè nan konsantrasyon an Jadendanfan nan 100nM ak 250nM se pi bon, ak relasyon an lineyè nan konsantrasyon an Jadendanfan nan 500nM se relativman pòv.Nan 100nM ak 250nM, valè Ct 250nM relativman piti, kidonk konsantrasyon primè pi bon an se 250nM.Anjeneral, dimers jadendanfan grav ka wè nan koub la k ap fonn.E si primè ki fèt yo pa ka evite primè-dimè?
Metòd 3: Diminye kantite primè yo epi ogmante tanperati a annealing (pa bezwen eksplike).
Valè anpirik tanperati recuit se 60°C.Si ou pa fin sèten, ki jan yo chwazi yon tanperati rkwir ki pi apwopriye?Repons lan se menm jan ak chwa nan konsantrasyon Jadendanfan -tès gradyan.Pran yon foto nan konpayi Bio-rad pou ilistre pwoblèm nan.Pou anplifikasyon yon sèten fragman sib, mete uit gradyan tanperati, chak ak twa repetisyon, ak koub anplifikasyon yo jwenn se jan sa a:

seleksyon tanperati rkwit:
·70 ° C, 69 ° C — Fondamantalman, primè yo pa ka konbine, kidonk pa gen okenn anplifikasyon.
·67.3 ° C - Gen yon ti kantite anplifikasyon nan kòmansman an, ak valè Ct la se relativman gwo.
·64.5°C——Valè Ct la diminye.
·Nan 60.7°C, 58.0°C, 56.2°C, ak 55.0°C, valè Ct fondamantalman gen tandans pou stab, men valè fluoresans final yo te diferan.
Ki jan yo chwazi?Prensip: Premye prensip la se valè Ct ki pi wo a.Pou menm valè Ct, chwazi yon tanperati rkwit ki pi wo pou evite dimerizasyon ak anplifikasyon ki pa espesifik.Malgre ke gen yon valè fluoresans ki pi wo nan 55 ° C, ka gen dimè oswa anplifikasyon ki pa espesifik nan li.
Men, si ou se entelijan menm jan ak ou, ou pral definitivman panse: Lojikman pale, si reyaksyon an PCR trè espesifik, osi lontan ke konsantrasyon nan Jadendanfan depase egzijans minimòm, pwen yo wo ak ba pa ta dwe gen okenn efè, menm jan ak koloran fliyoresan ak dNTPs.Vreman vre, osi lontan ke tanperati a annealing optimize byen, efè a nan konsantrasyon Jadendanfan sou valè Ct pral natirèlman minimize.

Tanperati rkwit la optimize byen, epi efè konsantrasyon Jadendanfan sou CT yo pral minimize
Estrikti segondè afekte efikasite anplifikasyon
Ann pran foto nan Bio-rad pou ilistre pwoblèm nan.Li tou desine yon gradyan tanperati pou anplifye yon jèn ak yon estrikti segondè.

Segondè estrikti parèt
Li ka wè ke kòm gradyan tanperati a diminye, pwodwi yo kòmanse parèt ak valè Ct la deplase pi devan, rive nan valè a minimòm nan 60.7 ° C, ak Lè sa a, kòm gradyan tanperati a diminye, valè Ct la vin pi gwo.Kontrèman, kòm tanperati a ogmante, estrikti segondè a ouvè ak efikasite anplifikasyon an ogmante.Apre yo rive nan yon sèten tanperati, ogmante tanperati a pa ka amelyore efikasite anplifikasyon.Paske primè yo pa ka byen konbine nan moman sa a.Se poutèt sa,chèche tanperati ki gen valè Ct ki pi ba a, ki se tanperati ki pi bon pou anplifye modèl estrikti segondè a!Natirèlman, moun san konprann dwe konnen ke si li pa nesesè, li pi bon pou chanje primè yo epi evite rejyon an estrikti segondè.
5. Nivo aplikasyon
MIQE - Analiz done

Se analiz done a sitou bay pa enstriman an PCR fliyoresan quantitative.Nan atik anvan an, yo te fè anpil travay analiz done, tankou kontwòl vid la, ki te eksplike nan desen an nan eksperyans la.Jèn referans entèn yo, nimewo repete, elatriye yo te klarifye., isit la nou sitou eksplike aplikasyon qPCR.
qPCR lajman itilize, ak verifikasyon eksperimantal ak dyagnostik asid nikleyik se senaryo ki pi souvan itilize yo.
quantifikasyon absoli
Log (inisyal konsantrasyon) gen yon relasyon lineyè ak kantite sik.Yon koub estanda ka trase nan yon estanda ki gen nimewo kopi inisyal li te ye, se sa ki, yo ka jwenn relasyon lineyè reyaksyon anplifikasyon an.Dapre valè Ct echantiyon an, yo ka kalkile konsantrasyon nan echantiyon an.Kantite modèl yo enkli.

Metòd Kalkil Kantitatif Absoli
Kantifikasyon absoli dwe baze sou koub estanda a.Pou fè yon koub estanda, yo mande yon estanda.Anjeneral, estanda a se yon plasmid ki jwenn nan klonaj jèn sib la.Poukisa se yon plasmid?Paske ADN plasmid sikilè ki pi estab.Delye pwodwi estanda a nan 5 a 6 gradyan dapre rapò a double (dilution 10-pliye), epi peye atansyon sou inifòmite a lè dilye.Se pou valè Ct la tonbe ant 15-30.

Preparasyon estanda
An menm tan an, echantiyon an yo dwe teste tou ta dwe dilye kòmsadwa (sonje faktè a dilution), ak valè a Ct ta dwe tou tonbe ant 15-30.Pwodwi estanda a + echantiyon yo dwe teste yo mete sou machin nan ansanm.Apre kouri a, yo te fè yon koub estanda ak sibstans estanda a, epi echantiyon yo dwe teste yo te pote nan koub estanda a pou kalkile konsantrasyon an.
Kantifikasyon HBV viris epatit B se yon kantite absoli tipik, ki ka kalkile nimewo kopi viris la nan 1ml san.
Kalkil nimewo kopi
Konsantrasyon echantiyon yo dwe teste (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × faktè dilution
Egzanp pwa molekilè = kantite baz × 324
Nimewo kopi echantiyon an yo dwe teste (kopi/ul) = konsantrasyon echantiyon an yo dwe teste / pwa molekilè echantiyon an × 6 × 1014

Metòd kalkil nimewo kopi

Pi wo a se metòd kalkil pou detèmine kantite a.Sa a se yon pwoblèm matematik ki ka rezoud apre yo fin gradye nan lekòl segondè, epi pwoblèm matematik yo jeneralman rezoud pa òdinatè.Si ou pa konprann, ou ka vin kominike.
quantifikasyon relatif
Kantifikasyon relatif se sitou itilize nan rechèch syantifik.Konbyen viris ki genyen nan 1ml san, epi li se yon viris ADN, sa a se yon evènman relativman detèminist: yo ka detèmine kantite san an, ak viris ADN an relativman estab.Sepandan, li difisil pou nou konpare kantite kopi transkripsyon yon jèn sèten nan yon fèy, paske li difisil pou detèmine gwosè, pwa, ak tandrès fèy la, kantite extrait RNA difisil pou detèmine, ak efikasite transcription ranvèse tou difisil pou detèmine, sa vle di, nenpòt etap ka fè done eksperimantal yo gen pinèz epi yo pa ka itilize.
Se poutèt sa, quantifikasyon relatif dwe prezante yon eleman:jèn referans entèn la.
Nan lòt mo, quantification relatif se aktyèlman yon konparezon ant jèn nan sib ak jèn referans entèn la.Konpare nan menm tisi a ak menm selil la, enfliyans gwosè echantiyon an, kantite ekstraksyon RNA, efikasite transcription ranvèse, ak efikasite PCR relativman piti.Akòz ti gwosè echantiyon an, tou de jèn referans entèn yo ak jèn sib yo te relativman redwi.Se poutèt sa nou te mete aksan sou inifòmite ak estabilite anvan.
Jèn referans entèn yo jeneralmanjèn antretyen(Jèn kenbe kay), ki refere a yon klas jèn ki estab nan tout selil yo, ak pwodwi yo nesesè pou kenbe aktivite lavi debaz selil yo.
Pa konfonn konsèp sa a.Jèn Housekeeping se tèm fonksyon byolojik, pandan y ap jèn referans entèn yo se tèm eksperimantal teknik.Jèn Housekeeping bezwen pase validation anvan yo ka chwazi kòm jèn referans entèn yo.
Pou egzanp, nou chwazi plizyè jèn antretyen nan figi ki anba a pou teste nivo ekspresyon yo nan selil tisi diferan, epi nou jwenn ke nivo ekspresyon β-2-mikroglobulin yo te byen diferan de sa yo ki nan twa lòt jèn yo, kidonk yo pa t 'kapab itilize kòm jèn referans entèn yo.

Apre konprann fonksyon koreksyon jèn referans entèn la, de algoritm yo sòti akòz entwodiksyon jèn referans entèn la.
· doub metòd koub estanda
·2 – △△Ct metòd (metòd konparezon valè CT)
Si ou enterese nan etidye espès ak fonksyon jèn, tanpri abandone rechèch la sou algoritm epi sèvi ak fòmil dirèkteman, oswa itilize machin dirèkteman;si ou se yon nèg dwat nan matematik ak jeni, tanpri santi yo lib.
doub metòd koub estanda
Kantite jèn sib la ak jèn antretyen nan echantiyon kontwòl la ak echantiyon yo dwe teste atravè koub estanda a, ak Lè sa a, kalkile valè relatif la dapre fòmil kalkil la, ki se nivo ekspresyon relatif la.
Avantaj: analiz senp, optimize eksperimantal relativman senp
Dezavantaj: Pou chak jèn, chak wonn eksperyans dwe fè yon koub estanda
Aplikasyon: Youn nan de metòd ki pi souvan itilize ak rekonèt relatif quantitative nan etid la nan règleman ekspresyon jèn.
Fòmil la se jan sa a:

Egzanp yo se jan sa a:

Kalkile kantite lajan relatif ki baze sou rezilta quantitative a
2 – △△Ct metòd (metòd konparezon valè CT)

Avantaj: Pa bezwen fè yon koub estanda
Dezavantaj: Li sipoze ke efikasite anplifikasyon an se tou pre 100%;devyasyon estanda a se <5%, ak koub estanda a ak efikasite ant chak anplifikasyon yo sipoze konsistan;optimize kondisyon eksperimantal yo pi konplike.
Aplikasyon: Youn nan de metòd ki pi souvan itilize ak rekonèt relatif quantitative nan etid la nan règleman ekspresyon jèn.

Natirèlman, efikasite anplifikasyon an anjeneral enposib yo dwe parfe 1. Metòd koreksyon: Si nou konnen ke jèn nan sib ak jèn referans la gen menm efikasite anplifikasyon an, men efikasite anplifikasyon an pa egal a 1, Lè sa a, 2－△△Ct ka korije kòm: (1 + E )－△△Ct la, pou egzanp, ka korije fòmilasyon an, 95. 1.95－△△Ct
Jiskaprezan, kontni an sou fluoresan PCR quantitative rive nan yon fen.