Fluorescence quantitative PCR (ke yo rele tou TaqMan PCR, ke yo rele FQ-PCR) se yon nouvo teknoloji quantitative asid nikleyè devlope pa PE (Perkin Elmer) nan Etazini an 1995. Teknoloji sa a baze sou PCR konvansyonèl lè yo ajoute sond fluorescent ki make.Konpare ak PCR fleksib, FQ-PCR gen anpil avantaj pou reyalize fonksyon quantitative li yo.Atik sa a gen entansyon dekri yon ti tan karakteristik, prensip, metòd, ak aplikasyon teknoloji a.
1 Karakteristik
FQ-PCR pa sèlman gen sansiblite segondè nan PCR òdinè, men tou, akòz aplikasyon an nan sond fliyoresan, li ka dirèkteman detekte chanjman nan siyal fliyoresan pandan anplifikasyon PCR atravè sistèm kondiksyon foto-elektrik la jwenn rezilta quantitative, ki genyen batay anpil enpèfeksyon nan PCR konvansyonèl, kidonk li tou gen espesifik nan segondè nan ibridizasyon ADN ak presizyon nan segondè teknoloji spectroscopy.
Pou egzanp, pwodwi PCR jeneral yo bezwen obsève pa elektwoforèz jèl agarose ak tach bromur etidyòm ak limyè iltravyolèt oswa pa elektwoforèz jèl poliakrilamid ak tach ajan.Sa a pa sèlman mande pou plizyè enstriman, men tou, pran tan ak efò.Tach yo itilize Ethidium bromide se danjere nan kò imen an, ak pwosedi eksperimantal konplike sa yo bay opòtinite pou polisyon ak fo pozitif.Sepandan, FQ-PCR sèlman bezwen louvri kouvèti a yon fwa pandan chaj echantiyon, ak pwosesis ki vin apre a se operasyon konplètman fèmen-tib, ki pa mande pou PCR pòs-pwosesis, evite anpil dezavantaj nan operasyon PCR konvansyonèl yo.Eksperyans lan jeneralman itilize siklis tèmik ABI7100 PCR devlope pa konpayi PE.
Enstriman an gen karakteristik sa yo: ① Aplikasyon lajè: Li ka itilize pou quantification pwodwi ADN ak RNA PCR, rechèch ekspresyon jèn, deteksyon patojèn, ak optimize kondisyon PCR.② Prensip inik quantitative: Lè l sèvi avèk sond ki gen etikèt fluorescent, kantite fliyoresans pral akimile ak sik PCR la apre eksitasyon lazè, konsa pou reyalize objektif quantification.③ Segondè efikasite k ap travay: 9600 PCR tèmik sikilasyon entegre, òdinatè kontwole 1 a 2 èdtan pou konplete anplifikasyon ak quantifikasyon 96 echantiyon otomatikman ak synchrone.④ Pa bezwen elektwoforèz jèl: Pa bezwen delye ak elektwoforèz echantiyon an, jis itilize yon pwofonde espesyal pou detekte dirèkteman nan tib reyaksyon an.⑤Pa gen polisyon nan tiyo a: Tib reyaksyon inik konplètman fèmen ak sistèm kondiksyon foto-elektrik adopte, kidonk pa gen okenn bezwen enkyete sou polisyon.⑥Rezilta yo repwodiktif: ranje dinamik quantitative a se jiska senk lòd nan grandè.Se poutèt sa, depi teknoloji sa a te devlope avèk siksè, anpil chèchè syantifik te apresye li e li te aplike nan anpil domèn.
2 Prensip ak metòd
Prensip travay FQ-PCR se pou itilize aktivite exonuclease 5′→3′ Taq anzim pou ajoute yon pwofonde ki gen etikèt fluorescent nan sistèm reyaksyon PCR la.Pwofonde a ka spesyalman ibrid ak modèl ADN ki nan sekans primè a.Se 5'end nan pwofonde a make ak fluoresans emisyon jèn FAM (6-carboxyfluorescein, fluoresans emisyon pik nan 518nm), ak 3'end la make ak gwoup la fluoresans trempe TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine, fluoresans emisyon an nan fluoresans phosphor 832'beak tom) anpeche sond la pwolonje pandan anplifikasyon PCR.Lè pwofonde a rete entak, gwoup quencher la siprime emisyon fliyoresan gwoup emisyon an.Yon fwa gwoup emisyon an separe de gwoup trempe an, anpèchman an leve, epi dansite optik la nan 518nm ogmante epi li detekte pa sistèm deteksyon fliyoresan an. Nan faz renaturasyon an, sond la ibrid ak ADN modèl la, ak anzim Taq nan faz ekstansyon an deplase ansanm modèl ADN ak ekstansyon primè a.Lè pwofonde a koupe, efè a trempe lage epi siyal fliyoresan an lage.Chak fwa yo kopye modèl la, yo koupe yon sond, akonpaye pa lage yon siyal fliyoresan.Depi gen yon relasyon youn-a-yon ant kantite fluorophores lage ak kantite pwodwi PCR, teknik sa a ka itilize pou byen mezire modèl la.Enstriman eksperimantal la jeneralman itilize siklis tèmik ABI7100 PCR devlope pa konpayi PE, ak lòt siklis tèmik ka itilize tou.Si yo itilize sistèm reyaksyon kalite reyaksyon ABI7700 pou eksperyans lan, apre yo fin reyaksyon an fini, rezilta quantitative yo ka bay dirèkteman nan analiz òdinatè.Si ou itilize lòt siklis tèmik, ou bezwen sèvi ak yon detektè fluoresans pou mezire siyal fluoresans nan tib reyaksyon an an menm tan pou kalkile RQ+, RQ-, △RQ.RQ + reprezante rapò a entansite luminesans nan gwoup la emisyon fliyoresan nan tib echantiyon an ak entansite a luminesans nan gwoup la trempe, RQ- reprezante rapò a de nan tib la vid, △RQ (△RQ = RQ + -RQ-) reprezante kantite chanjman siyal fluoresans pandan PCR Apre rezilta done yo ka jwenn, ka jwenn pwosesis quantitative.Akòz entwodiksyon de sond fliyoresan, espesifik eksperyans nan amelyore siyifikativman.Konsepsyon ankèt la ta dwe jeneralman satisfè kondisyon sa yo: ① Longè pwofonde a ta dwe apeprè 20-40 baz pou asire espesifik nan obligatwa.② Kontni baz GC yo se ant 40% ak 60% pou evite repetisyon sekans nukleotid sèl.③ Evite ibridizasyon oswa sipèpoze ak primè.④ Estabilite nan obligatwa ki genyen ant pwofonde a ak modèl la pi gran pase estabilite nan obligatwa ki genyen ant Jadendanfan an ak modèl la, kidonk valè Tm nan pwofonde a ta dwe omwen 5 ° C pi wo pase valè Tm nan Jadendanfan an.Anplis de sa, konsantrasyon an nan pwofonde a, omoloji ki genyen ant pwofonde a ak sekans modèl la, ak distans ki genyen ant pwofonde a ak Jadendanfan an tout gen yon enpak sou rezilta eksperimantal yo.
Pwodwi ki gen rapò:
Lachin an tan reyèl PCR Easyᵀᴹ-Taqman manifakti ak founisè |Foregene (foreivd.com)
Tan poste: Oct-15-2021
