Real Time PCR, ke yo rele tou quantitative PCR oswa qPCR, se yon metòd pou siveyans an tan reyèl ak analiz de pwodwi anplifikasyon PCR.
Paske PCR quantitative gen avantaj ki genyen nan operasyon senp, rapid ak pratik, sansiblite segondè, repetibilite bon, ak to kontaminasyon ki ba, li se lajman ki itilize nan tès medikal, evalyasyon efikasite dwòg, rechèch ekspresyon jèn, rechèch transjenik, deteksyon jèn, deteksyon patojèn, deteksyon bèt ak plant., tès manje ak lòt jaden.
Se poutèt sa, si ou angaje nan rechèch debaz nan syans lavi, oswa anplwaye nan konpayi pharmaceutique, konpayi elvaj bèt, konpayi manje, oswa menm anplwaye nan enspeksyon antre-sòti ak biwo karantèn, depatman siveyans anviwònman, lopital ak lòt inite, ou pral plis oswa mwens ekspoze a oswa ou bezwen konnen konesans nan metrize PCR quantitative.

Prensip tan reyèl PCR

Real Time PCR se yon metòd kote sibstans fliyoresan yo ajoute nan sistèm reyaksyon PCR la, epi entansite siyal fliyoresan nan pwosesis reyaksyon PCR kontwole an tan reyèl pa yon enstriman PCR quantitative, epi finalman done eksperimantal yo analize ak trete.

【Koub anplifikasyon】se koub ki dekri pwosesis dinamik PCR la.Koub anplifikasyon PCR se pa aktyèlman yon koub eksponansyèl estanda, men se yon koub sigmoid.

[Platfòm faz koub anplifikasyon]Avèk ogmantasyon kantite sik PCR, inaktivasyon ADN polymerase, rediksyon dNTP ak primè, ak anpèchman reyaksyon sentèz la pa pirofosfat reyaksyon pa pwodwi, elatriye, PCR pa toujou elaji yon fason eksponansyèl., epi evantyèlman pral antre nan yon plato.

[Rejyon kwasans eksponansyèl koub anplifikasyon]Malgre ke faz plato a varye anpil, nan yon rejyon sèten nan rejyon kwasans eksponansyèl koub anplifikasyon an, repetibilite a trè bon, ki trè enpòtan pou analiz quantitative PCR.

[Valè papòt ak valè Ct]Nou mete valè limit deteksyon fliyoresans nan pozisyon ki apwopriye a nan zòn kwasans eksponansyèl koub anplifikasyon an, sètadi valè papòt (Threshold).Entèseksyon valè papòt la ak koub anplifikasyon an se valè Ct, se sa ki, valè Ct refere a kantite sik (Sik papòt) lè valè papòt la rive.

Graf ki anba a montre aklè relasyon ki genyen ant liy papòt ak koub anplifikasyon, papòt ak valè Ct.

【Ki jan yo quantifier?】

Li te pwouve pa teyori matematik ke valè Ct la gen yon relasyon lineyè envès ak logaritm nan kantite modèl inisyal yo.Real Time PCR kontwole pwodwi anplifikasyon PCR an tan reyèl ak quantifies yo pandan faz anplifikasyon eksponansyèl la.

Pou chak sik PCR, ADN nan ogmante eksponansyèlman pa 2 fwa, epi byento rive nan yon plato.

Sipoze kantite ADN kòmanse se A₀ , apre n sik, kantite teyorik pwodwi ADN ka eksprime kòm:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Lè sa a, plis kantite ADN inisyal A 0 ye, pi bonè kantite pwodwi anplifye a rive nan valè deteksyon An, ak kantite sik lè yo rive nan An se valè Ct la.Sa vle di, plis kantite ADN inisyal A 0 ye, se pik koub anplifikasyon an pi bonè, epi kantite sik n ki nesesè yo pi piti.

Nou pote dilution gradyan nan estanda konsantrasyon li te ye a epi sèvi ak li kòm yon modèl pou Real Time PCR, epi yo pral jwenn yon seri koub anplifikasyon nan entèval egal nan lòd la kòmanse kantite ADN soti nan plis rive mwens.Dapre relasyon lineyè ant valè Ct ak logaritm kantite modèl kòmanse, a[kob estanda] ka kreye.

Lè w ranplase valè Ct echantiyon an ak konsantrasyon enkoni nan koub estanda a, yo ka jwenn kantite modèl inisyal echantiyon an ak konsantrasyon enkoni, ki se prensip quantitative Real Time PCR.

Metòd deteksyon an tan reyèl PCR

Real Time PCR detekte pwodwi anplifikasyon PCR pa detekte entansite fliyoresans nan sistèm reyaksyon an.

Prensip Fluoresan Dye Embedding Metòd】

Koloran fliyoresan, tankou TB Green ® , ka pa espesifikman mare nan ADN doub-chèn nan sistèm PCR epi fliyoresan lè yo mare.

Entansite fliyoresans nan sistèm reyaksyon an ogmante eksponansyèlman ak ogmantasyon nan sik PCR.Lè w detekte entansite fliyoresans lan, yo ka kontwole kantite anplifikasyon ADN nan sistèm reyaksyon an an tan reyèl, ak Lè sa a, kantite modèl la kòmanse nan echantiyon an ka ranvèse estime.

【Prensip metòd sonde fliyoresan】

sond fliyoresanse yon sekans asid nikleyik ak yon gwoup fliyoresan nan fen 5′ ak yon gwoup trempe nan fen 3′, ki ka espesyalman mare nan modèl la.Lè sond la entak, fliyoresans ki emèt pa fluorophore a etenn pa gwoup la asouvisman epi li pa ka fliyoresan.Lè pwofonde a dekonpoze, sibstans fliyoresan an ap disoye ak emèt fliyoresans.

Yo ajoute yon pwofonde fliyoresan nan solisyon reyaksyon PCR la.Pandan pwosesis la recuit, pwofonde fliyoresan an pral mare nan pozisyon espesifik modèl la.Pandan pwosesis ekstansyon an, aktivite eksonukleaz 5′→3′ nan anzim PCR la ka dekonpoze pwofonde fliyoresan ibrid ak modèl la, epi sibstans fliyoresan an dissocie pou emèt fliyoresans.Lè yo detekte entansite fliyoresans pwofonde a nan sistèm reyaksyon an, objektif pou kontwole kantite anplifikasyon pwodwi PCR la ka reyalize.

【Seleksyon Metòd Deteksyon Fluoresans】

Si yo itilize li pou fè distenksyon ant sekans ak omoloji segondè epi fè deteksyon PCR multiplex tankou analiz SNP sezisman, metòd pwofonde fliyoresan an iranplasabl.
Pou lòt eksperyans PCR an tan reyèl, yo ka itilize yon metòd chimè fliyoresan ki senp, fasil ak pri ki ba.

sondesBò spesifik, ki kapab multiplex PCR

Enpèfeksyon

Segondè kondisyon espesifik pou anplifikasyon;

PCR multiplex pa ka fè Bezwen konsepsyon sond espesifik, gwo pri;

pafwa konsepsyon sonde difisil

Pwodwi ki gen rapò: