Tout moun ap pale sou prensip eksperyans qRT-PCR, konsepsyon primè, entèpretasyon rezilta, elatriye, men mwen panse mwen ta dwe pataje avèk ou operasyon eksperimantal qRT-PCR.Li piti, men li se sou rezilta yo.
Anvan w fè qRT-PCR, nou bezwen gen yon konpreyansyon klè sou pwòp RNA pa nou ak metòd operasyon yo.Apre yo tout, efò nou yo vize jwenn rezilta, olye ke senpleman pratike.Se konsa, anvan ou fè qRT-PCR, nou bezwen detèmine pwoblèm sa yo (kèk nan yo ki aplikab sèlman nan SYBR).
1 Èske w sèten RNA w pa degrade?
NanoDrop 2000 ka sèlman detekte konsantrasyon ak pite RNA, men li pa ka detekte entegrite RNA.
Valè RNA (RNA Intesity Number) ka reflete entegrite RNA a, ki detekte pa sistèm Bioanalyzer Agilent 2100 la.
Fig. Dyagram eskematik valè RIN pou diferan echantiyon RNA (ekaryot)
Sepandan, laboratwa jeneralman pa gen Agilent 2100 Bioanalyzer.Nan ka sa a, nou ka detekte nan jèl fòmaldeyid, men egzijans pou kantite total RNA a wo, kidonk metòd ki pi rapid la se sèvi ak elektwoforèz jèl òdinè.Li oblije nan yon anviwònman san nukleaz, kidonk li nesesè rense tank elektwoforèz la, boutèy Sol, bracket jèl ak peny ak dlo DEPC.Agarose la tou san nukleaz (osi lontan ke li fèk louvri), epi Tanpon Loading la ta dwe frèch louvri otank posib, ak 1.2% jèl.
Remake byen ke jèl la dwe konplètman fonn, otreman li pral lakòz bann inhomogeneous, jan yo montre nan echantiyon 9 nan figi a.Si vòltaj la twò wo oswa kouri pou twò lontan ap jenere chalè ak lakòz degradasyon RNA, kidonk vòltaj la ak tan yo ta dwe kontwole rezonab.Anplis de sa, jèl kouri kapab tou plis detèmine si gen rezidi ADN nan echantiyon an, epi obsève si gen yon gwo kantite gwoup kenbe nan byen nan dispans.
Figi.Jèl elektwoforèz deteksyon nan RNA
2 Èske w sèten sou konsantrasyon cDNA ou a?
Eksperyans nan gwo frè yo nan laboratwa a se ke cDNA nan sistèm nan 20 ul jwenn nan chak envèsyon se dirèkteman dilye 20X, pandan y ap sè yo post-doktora yo dilye 10X.Mwen anjeneral depann sou sitiyasyon an.Paske bon jan kalite a nan RNA a mansyone pa chak moun diferan, nivo nan ranvèse se tou diferan, ak teknoloji a ranvèse ka pa estab.
Se konsa, chak fwa mwen jwenn cDNA ranvèse a, mwen pral premye delye li apeprè 3 fwa, ak Lè sa a, sèvi ak jèn nan antretyen fè RT-PCR, kantite sik se jeneralman 25 sik, yo idantifye konsantrasyon an espesifik, ak Lè sa a, detèmine faktè dilution final la.
3 Èske w sèten primè ou yo fasil pou itilize?
Li ka pase koub k ap fonn qRT-PCR, men sa toujou koute lajan.Pou laboratwa ki pa gen anpil lajan, lè yo jwenn anpil primè yo, yo ka sèvi ak RT-PCR òdinè pou wè si se yon gwoup sèl epi idantifye espesifikasyon primè yo.Si laboratwa a pa kout nan lajan, espesifik nan tout primè ka idantifye yon fwa nan koub la k ap fonn.
4 Èske w asire w ke kondisyon eksperimantal ou yo apwopriye?
SYBR ta dwe pwoteje kont limyè fò, kidonk eseye fèmen limyè anlè a lè w ajoute reyaktif SYBR, epi sèlman bezwen sèvi ak limyè dim pou konplete li.
Sere SYBR nan 4°C.Lè w ap itilize, dousman ranvèse leve, li desann pou melanje byen pou evite kimen, epi pa toubiyon kouray.
Gen kèk ti sè ki renmen trase mak sou tablo PCR la pou yo pè melanje echantiyon yo, sa ki mal.Paske makè ou yo gen anpil chans pou afekte koleksyon siyal fliyoresan, mwen jeneralman rekòmande pou timoun piti yo sèvi ak kaye eksperimantal pou ede nan memwa, jan yo montre anba a.
Figi.qRT-PCR echantiyon chaj dyagram
5 Èske w sèten w ap fè li byen?
Asire w ou mete gan, mete gan, mete gan, epi di bagay enpòtan twa fwa.
Yo nan lòd yo diminye ekspoze a nan SYBR nan limyè, pèsonèlman mwen renmen ajoute yon modèl an premye, jan yo montre nan figi ki anba a.Dapre eksperyans, adisyon a nan yon ti kantite modèl gen chans rive nan lakòz erè echantiyon.Se poutèt sa, yo nan lòd yo minimize erè a ki te koze pa ajoute yon ti kantite modèl, anjeneral mwen double echantiyon an ankò, epi double kantite lajan an lè ajoute echantiyon an diminye kantite H2O2 te ajoute.
Figi.Dyagram chema chajman qRT-PCR
Lè sa a, konfigirasyon sistèm qRT-PCR la jan sa a.
Figi.Dyagram preparasyon sistèm qRT-PCR
REMAK: Pwosesis konfigirasyon an dwe fèt sou glas.
Apre ou fin ajoute echantiyon an, kole fim nan sele transparan.Eseye pa manyen sifas la nan fim nan sele transparan ak men ou, jis opere nan espas ki la sou tou de bò nan fim nan.Paske anprent dwèt yo ka afekte tou koleksyon siyal fliyoresan yo.Lè sa a, sèvi ak yon santrifujeur byen vit santrifuje pou 10 s nan vitès ki ba pou anpeche echantiyon an pandye sou miray la.
Pwodwi ki gen rapò:
Lè poste: Apr-28-2023
