Eksperyans RT-qPCR gen ladan ekstraksyon RNA ak evalyasyon kalite, transcription ranvèse ak qPCR twa etap, chak etap gen yon anpil nan prekosyon, nou pral prezante an detay anba a.

Ⅰ.Evalyasyon kalite RNA

Nan eksperyans RT-qPCR, apre yo fin fè ekstraksyon RNA, yo dwe evalye bon jan kalite a nan RNA, epi eksperyans swivi a ka fèt sèlman apre li fin kalifye.Metòd evalyasyon yo genyen ladan yo spectrophotometer, Agilent jèl elèktroforèz, Agilent 2100 analiz, nan mitan ki pi souvan itilize spectrophotometer ak agarose jèl elektwoforèz metòd deteksyon.Li ta dwe remake ke de metòd sa yo bezwen yo dwe itilize ansanm pou konplete deteksyon an ak analiz nan konsantrasyon RNA, pite ak entegrite, konsa tankou asire bon jan kalite a nan RNA.

Twous Izolasyon RNA ki gen rapò: 

Twous izolasyon RNA total selilè

Ou ka jwenn RNA total ki trè pirifye ak bon jan kalite nan plizyè selil kiltive nan 11min.

Animal Total RNA izole Twous

Byen vit ak efikasite ekstrè-wo pite ak-wo kalite total RNA soti nan tisi bèt divès kalite.

Spectrophotometer:

Se spectrophotometer la sitou itilize detèmine konsantrasyon ak pite nan RNA, men li pa ka detekte entegrite nan RNA ak rezidi jenomik.Pami yo, A260/280 ak A260/230 se paramèt enpòtan pou deteksyon pite RNA, epi yo ka detekte pite RNA dapre fluctuation valè yo:

1. 1.9 < A260/280 < 2.1, ki endike ke RNA pite se yon bon bagay;A260/280<1.9, ki endike ke ka gen rezidi pwoteyin nan RNA;A260/280> 2.1, ki endike posib degradasyon pasyèl nan RNA, ki ka plis konfime pa elektwoforèz jèl agarose.

2. 2.0

Elektwoforèz jèl agaroz:

Egzamen elektwoforèz jèl Agarose ka analize entegrite RNA, genomic ak rezidi pwoteyin, men li pa ka byen mezire konsantrasyon RNA oswa detekte résidus reyaktif òganik yo.Pran modèl RNA ekaryotik pou egzanp:

1. RNA a te sibi elektwoforèz jèl agarose.Si te gen sèlman twa gwoup sèl nan 28sRNA, 18sRNA ak 5.8sRNA sou kat jeyografik la, li endike ke RNA a ekstrè se entak.Si gen yon fenomèn trenen, li endike degradasyon pasyèl nan RNA.

2. Si gen yon sèl bann klere ant twou lakòl la ak bann 28sRNA a, ka gen rezidi ADN jenomik.

3. Si bann parèt nan twou lakòl la, li endike ke ka gen résidus nan pwoteyin ak lòt sibstans makromolekilè.

Ⅱ. Ranvèse transcription

Apre ekstraksyon RNA fini, li bezwen ranvèse nan cDNA pou eksperyans ki vin apre yo, kidonk etap ranvèsman an esansyèl.Transkripsyon ranvèse pral prezante nan seleksyon an nan transkriptaz ranvèse ak Jadendanfan:

Seleksyon ranvèse transkriptaz:

Transkriptaz ranvèse tipik yo enkli AMV RTase ak MMLV RTase.RNase H nan AMV RTase gen aktivite fò, longè sentèz kout, kantite sentèz ki ba ak bon estabilite tèmik (42 ~ 55 ℃).Aktivite RNase H nan MMLV RTase fèb, longè sentèz la long, kantite sentèz la wo, epi estabilite tèmik la pòv (37 ~ 42 ℃).

Paske anzim RNase H gen fonksyon degrade modèl RNA, MMLV ak aktivite RNase H fèb yo ta dwe chwazi preferans pandan transcription ranvèse, epi apre jeni jenetik pita, estabilite tèmik MMLV te rive nan yon kwasans kalitatif.Pran ForegeneForeasy Reverse Transcriptase (M-MLV pou transkripsyon ranvèse) kòm yon egzanp, li se yon nouvo transkriptaz ranvèse ki eksprime nan E. coli enjenyè bakteri lè l sèvi avèk teknoloji recombination jenetik.Li se yon ADN polymerase recombinant ki sentèz yon seksyon ADN konplemantè ki soti nan RNA yon sèl, ADN, oswa yon ibrid RNA:ADN.Li pa gen okenn aktivite RNase H, estabilite fò, afinite RNA fò, ak sansiblite deteksyon segondè.

 

Foreasy Reverse Transcriptase (M-MLV pou transkripsyon ranvèse)

Seleksyon Jadendanfan:

Anjeneral RT primè yo tonbe nan twa kategori: oligo dT, primè o aza, ak primè espesifik jèn yo.Chwazi primè apwopriye pou itilize selon diferan kondisyon eksperimantal.

1. Si modèl la gen orijin ekaryotik epi yo itilize cDNA an reta pou anplifikasyon PCR woutin, Oligo (dT) rekòmande;Si yo itilize eksperyans ki vin apre a sèlman pou qPCR, Oligo (dT) rekòmande pou melanje ak primè o aza pou amelyore efikasite transkripsyon ranvèse.

2. Si modèl la soti nan prokaryot, yo ta dwe chwazi Primè o aza oswa premye jèn espesifik pou transkripsyon ranvèse.

Ⅲ.qPCR

Kantifikasyon fluoresans sitou elabore nan seleksyon an nan metòd quantitative, prensip konsepsyon Jadendanfan, seleksyon ROX, konfigirasyon sistèm reyaksyon ak anviwònman reyaksyon, elatriye.

Seleksyon metòd quantitative:

Metòd quantitative yo divize an metòd quantitative relatif ak metòd quantitative absoli.Kantifikasyon relatif yo ka itilize pou detekte efè sèten metòd tretman sou ekspresyon jèn, detekte diferans ekspresyon jèn nan diferan moman epi konpare diferans ekspresyon jèn nan tisi diferan.Kantifikasyon absoli ka detekte kantite asid nikleyik nan viris la ak sou sa.Lè n ap fè eksperyans, nou dwe chwazi metòd quantitative ki apwopriye yo dapre pwòp eksperyans nou yo.

Prensip premye konsepsyon:

Konsepsyon Jadendanfan pou qPCR dirèkteman gen rapò ak efikasite anplifikasyon ak espesifikasyon pwodwi.Se poutèt sa, kòrèkteman konsepsyon bon primè se premye etap la nan siksè qPCR.Nan konsepsyon Jadendanfan an, yo ta dwe peye atansyon sou prensip sa yo lè w satisfè prensip konsepsyon Jadendanfan konvansyonèl yo:

1. Longè fragman sib la kontwole ant 100 ak 300 bp;

2. Cross-exon konsepsyon pou evite enfliyans ADN jenomik;

3. Jadendanfan ki fèt yo bezwen teste pou efikasite anplifikasyon, epi sèlman lè efikasite anplifikasyon an rive nan estanda (90-110%) yo ka itilize pou eksperyans quantitative;

4. Konsantrasyon Primer se anjeneral optimize ant 0.1uM ak 1.0uM.

Seleksyon nanROX:

Nan pwosesis la nan reyaksyon quantitative, ROX ka ajiste diferans nan chemen optik, erè pipet oswa diferans volim ki te koze pa evaporasyon ak kondansasyon inifòm, amelyore repetibilite nan rezilta yo.Sepandan, li ta dwe remake ke seleksyon an nan ROX gen rapò ak enstriman an.Si enstriman qPCR la gen fonksyon otomatikman korije diferans ki genyen ant twou, li pa bezwen ajoute ROX;otreman, li bezwen ajoute koreksyon ROX.Ti patnè nan achte reyaktif yo dwe dapre enstriman an itilize yo chwazi ROX ki kòrèk la, evite erè pita.

Preparasyon nan sistèm reyaksyon:

Volim reyaksyon 20ul ak 50ul pi pito.Afè sa yo ta dwe peye atansyon sou lè sistèm nan fòmile:

1. Sistèm reyaksyon an bezwen prepare pa vantilasyon nan ultra-pwòp workbench la, nouvo ddH₂Yo itilize O pou chak eksperyans;

2. Chak eksperyans bezwen prepare NTC pou verifye si gen polisyon nan sistèm nan, epi chak pè primè bezwen fè NTC lè w ap prepare sistèm lan;

3. Pou detekte si gen rezidi gDNA nan modèl RNA a, NRT ka prepare pou chak echantiyon pou deteksyon;

4. Lè w ap prepare sistèm lan, li rekòmande pou fè omwen 3 repetisyon teknik pou yon echantiyon;

5. Lè modèl la se cDNA, li rekòmande pou delye 5-10 fwa pou diminye efè anpèchman sistèm transcription ranvèse sou eksperyans qPCR.Li pi bon yo eksplore kantite modèl la pa gradyan, pou ke valè a CT tonbe ant 20-30;

6. Detèmine kantite reyaksyon ki nesesè yo, ogmante pa 5-10% sou baz kantite reyaksyon, epi kalkile kantite konfigirasyon volim;

7, sistèm nan prepare lè l sèvi avèk prensip la premix, melanje apre santrifujasyon epi asire pa gen okenn bul;

8, osi lwen ke posib yo chwazi sipòte consommables.

Ki gen rapò RT-qPCR Twous