Espesifik deteksyon

Nan pifò ka yo, objektif konsepsyon Jadendanfan se maksimize espesifik PCR la.Sa a se detèmine pa enfliyans nan plis oswa mwens previzib nan anpil varyab.Youn nan varyab enpòtan se sekans ki nan 3′fen Jadendanfan an.

Sa ki enpòtan, tès PCR ki fèt pou espesifik yo gen plis chans kenbe efikasite segondè sou yon seri dinamik lajè, paske tès la pa pwodui pwodwi anplifikasyon ki pa espesifik, kidonk konpetisyon ak reyaktif PCR oswa anpeche reyaksyon anplifikasyon prensipal la.

Natirèlman, nan kèk ka, spesifik se pa pi enpòtan an, pou egzanp, lè objektif la se kantite byen ki gen rapò men diferan patojèn, konsepsyon espesyal, optimize ak verifikasyon estanda yo mande yo.

Koub la k ap fonn se yon metòd estanda pou evalye espesifik anplikon yo, omwen an tèm de si wi ou non yo anplifye yon sèl sib.Sepandan, li dwe mete aksan sou ke koub yo k ap fonn yo ka twonpe paske, pou egzanp, yo ka afekte pa efè yo konbine nan primè ki pa pi bon ak konsantrasyon modèl ki ba.

P5 |Koub k ap fonn lan montre chanjman Tm yo jwenn nan de deteksyon diferan kantite de ADN sib yo.

A. Nan pi wo konsantrasyon (ad)), pa gen okenn evidan primè dimer apre mezi qPCR la fini.Kòm konsantrasyon modèl la diminye a 50 kopi (e), yon pwodwi ki pa espesifik kòmanse parèt epi li vin pwodwi a sèlman nan konsantrasyon ki pi ba a (f).

B. Tès la te anrejistre menm Tms nan tout konsantrasyon sib yo, epi pa te gen okenn dimè primè evidan menm nan konsantrasyon ki pi ba a (5 kopi).Lè w ap itilize de metòd deteksyon sa yo, pa gen okenn pwodwi anplifikasyon yo te detekte nan NTCs.

P5 montre koub disolisyon yo jwenn ak echantiyon kote modèl la prezan nan diferan konsantrasyon.P 5a montre ke nan de konsantrasyon ki pi ba yo, Tms yo nan pwodwi yo anplifikasyon ki pa espesifik pwodwi yo pi ba pase sa yo ki nan anplikon espesifik yo.

Li evidan, metòd deteksyon sa a pa ka itilize seryezman pou detekte sib ki egziste nan konsantrasyon ki ba.

Enteresan, NTCs, sa vle di, echantiyon ki pa gen okenn ADN ditou, pa t 'anrejistre (ki pa espesifik) pwodwi anplifikasyon, ki endike ke background genomic ADN ka patisipe nan ki pa espesifik anplifikasyon / polymerization.

Pafwa yo pa ka remèd premye background sa yo ak anplifikasyon ki pa espesifik, men li souvan posib pou konsepsyon yon metòd deteksyon ki pa gen anplifikasyon ki pa espesifik nan nenpòt konsantrasyon modèl ak NTC (P 5b).

Isit la, menm anrejistreman anplifikasyon konsantrasyon sib la ak yon Cq 35 pral pwodui yon koub disolisyon espesifik.Menm jan an tou, NTC yo pa montre okenn siy anplifikasyon ki pa espesifik.Pafwa, konpòtman deteksyon an ka depann de likè manman an, epi sèlman anplifikasyon ki pa espesifik yo detekte nan sèten konpozisyon tanpon, ki ka gen rapò ak diferan konsantrasyon Mg2 +.

Estabilite nan deteksyon

Optimizasyon Ta se yon etap itil nan verifikasyon anpirik ak pwosesis optimize deteksyon qPCR.Li bay yon endikasyon dirèk nan solidite nan seri Jadendanfan an lè li montre tanperati a (oswa ranje tanperati) ki pwodui Cq ki pi ba a san yo pa anplifye NTC la.

Diferans de a kat fwa nan sansiblite ka pa enpòtan pou moun ki gen ekspresyon mRNA segondè, men pou tès dyagnostik, li ka vle di diferans ki genyen ant rezilta pozitif ak fo negatif.

Pwopriyete Ta nan premye qPCR yo ka varye anpil.Gen kèk tès yo pa trè solid, epi si yo pa fèt anba valè Ta pi bon nan primè yo, yo pral byen vit tonbe.

Sa a enpòtan paske kalite deteksyon sa a souvan pwoblèm nan mond reyèl la, ak pite echantiyon an, konsantrasyon ADN, oswa prezans lòt ADN ka pa pi bon.

Anplis de sa, nimewo kopi sib la ka varye nan yon pakèt domèn, ak reyaktif yo, istansil plastik, oswa enstriman yo ka diferan de sa yo itilize lè mete tès la.

P6|Gradyan tanperati a montre diferan solidite deteksyon PCR.

A. Sèvi ak Mastermix Sensifast SYBR Bioline a (nimewo katalòg BIO-98050) pou fè PCR sou cDNA ki prepare nan RNA nan sèvo imen.

B. Sèvi ak enstriman Bio-Rad CFX qPCR pou anrejistre kat anplifikasyon ak koub disolisyon apalèn (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCCTAGG).

C. Grafik anplifikasyon ak koub k ap fonn ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).

D. Grafik anplifikasyon ak koub disolisyon GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).

E. Cqs anrejistre nan diferan tanperati recuit, ki montre diferans nan Cq anrejistre anba yon gradyan tanperati 7C.

P 6 montre yon rezilta tipik nan yon tès endezirab, kote qPCR te fèt lè l sèvi avèk yon gradyan Tas ant 59C ak 67C (P 6a), lè l sèvi avèk primè pou twa jèn sèvo imen espesifik.

Li ka wè nan graf anplifikasyon an ke primè Opalin yo lwen ideyal paske ranje Ta optimal yo trè etwat (Figi 6b), se sa ki, Cqs yo gaye anpil, sa ki lakòz Cqs yo te siyifikativman konpare ak optimal Cqs Low yo.

Metòd deteksyon sa a enstab epi li ka mennen nan anplifikasyon ki pa pi bon.Se poutèt sa, pè sa a nan premye yo ta dwe reamenaje.Anplis de sa, analiz la koub k ap fonn (insert) montre ke espesifik nan metòd deteksyon sa a kapab tou gen pwoblèm, paske koub la k ap fonn nan chak Ta diferan.

Metòd deteksyon ACSBG1 yo montre nan P 6c pi solid pase metòd deteksyon Opalin pi wo a, men li toujou lwen ideyal, epi li posib ke li ka amelyore.

Sepandan, nou mete aksan sou ke pa gen okenn koneksyon nesesè ant solidite ak spesifik, paske koub la disolisyon ki te pwodwi pa metòd deteksyon sa a montre menm valè pik nan tout Tas (insert).

Nan lòt men an, tès la solidite se pi plis toleran, pwodwi Cqs menm jan an nan yon pakèt domèn Tas, tankou nan tès GFAP yo montre nan P 6d.

Diferans nan Cqs yo jwenn nan menm ranje 8 degre Sèlsiyis la se mwens pase 1, ak koub la disolisyon (ankadreman) konfime karakteristik sa yo deteksyon nan seri tanperati sa a.Li enpòtan pou remake ke Tas kalkile a ak seri Ta aktyèl la ka trè diferan.

Gen anpil direktiv ki fèt pou ede chèchè yo desine primè efikas, pi fò nan yo ki baze sou règ ki te etabli depi lontan epi yo te peye anpil atansyon sou 3′fen primar yo.Li souvan rekòmande pou enkli yon G oswa C nan fen 3 'ak de baz G oswa C (GC kranpon), men pa plis pase de nan dènye 5 baz yo.

Nan pratik, règ sa yo ka gide chèchè yo, men yo pa nesesèman kòrèk nan tout sikonstans.

P7 |3′fen Jadendanfan an gen ti efè sou espesifik oswa efikasite.

A. Pozisyon primè yo pou jèn imen HIF-1α (NM_181054.2).

B. Sèvi ak likè manman Agilent Brilliant III SYBR Green (Numero Cat. 600882) pou anplifye sis atik tès yo.

C. Grafik anplifikasyon ak koub k ap fonn anrejistre pa enstriman CFX qPCR Bio-Rad la ak primè 3′end.NTC yo montre an wouj.

D. Dosye Cqs chak atik tès la

Pa egzanp, rezilta a nan P 7 kontredi règ 3′fen.Tout desen yo pwodwi fondamantalman menm rezilta yo, ak sèlman de konbinezon Jadendanfan ki mennen nan anplifikasyon ki pa espesifik nan NTC.

Sepandan, nou pa ka sipòte efè clip GC a, paske nan ka sa a, lè l sèvi avèk A oswa T kòm yon maksimòm de 30 baz pa diminye espesifik.

Tès C, kote F primè a fini nan GGCC, te anrejistre Cqs nan NTCs, ki endike ke yon moun ta ka vle evite sekans sa yo nan fen 30 la.Nou mete aksan sou ke sèl fason pou detèmine pi bon sekans 3′fen yon pè Jadendanfan se evalye kèk primè kandida eksperimantal.

Efikasite anplifikasyon

Sa ki enpòtan, byenke deteksyon PCR ki pa espesifik pa janm ka vin espesifik, efikasite anplifikasyon an ka ajiste ak maksimize nan plizyè fason diferan pa chanje anzim, likè manman an, aditif, ak kondisyon monte bisiklèt.

Pou evalye efikasite deteksyon PCR, li pi bon pou itilize yon seri dilution 10 oswa 5 fwa asid nikleyik sib la, se sa ki "metòd koub estanda".

Si yo itilize anplikon PCR oswa sib ADN sentetik pou jenere yon koub estanda, dilusyon seri sib sa yo ta dwe melanje ak yon kantite konstan ADN background (tankou ADN jenomik).

P8 |Koub dilution pou evalye efikasite PCR.

A. Sèvi ak primè pou HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA ak R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC ak Agilent's Brilliant III SYBR Green mastermix (nimewo katalòg 600882) pou PCR ak kondisyon koub k ap fonn.

B. Yo te transkri 100 ng RNA, yo te dilye 2 fwa, epi yo te dilye echantiyon cDNA seri dilye 5 fwa nan 1 ng ADN jenomik imen.Koub k ap fonn yo montre nan ensèk la.

C. Reyaksyon RT, dilution, ak dilution seri te repete pou dezyèm echantiyon cDNA a, ak rezilta yo te menm jan an.

P 8 montre de koub estanda, lè l sèvi avèk menm metòd deteksyon an sou de echantiyon cDNA diferan, rezilta a se menm efikasite, apeprè 100%, ak valè R2 a tou menm jan an, se sa ki, degre nan anfòm ant done eksperimantal yo ak liy regresyon an oswa done an Degre nan linearité.

De koub estanda yo konparab, men se pa egzakteman menm bagay la.Si objektif la se pou byen mezire sib la, li dwe remake ke li pa akseptab bay yon kalkil nimewo kopi san yo pa eksplike ensètitid la.

P9 |Ensètitid mezi ki asosye ak quantifikasyon lè l sèvi avèk yon koub estanda.

A. Sèvi ak primè pou GAPDH (NM_002046) pou fè PCR ak kondisyon koub k ap fonn.F: ACAGTTGCCATGTAGACC ak R: TAACTGGTTGAGCACAGG ak Mastermix Sensifast SYBR Bioline a (nimewo katalòg BIO-98050).

B. Tablo anplifikasyon, koub k ap fonn ak koub estanda ki anrejistre ak enstriman CFX qPCR Bio-Rad la.

C. Grafik koub estanda ak 95% entèval konfyans (CI).

D. Nimewo kopi ak entèval konfyans 95% twa valè Cq ki sòti nan koub dilution la.

P 9 montre ke pou yon tès optimize, varyabilite nannan nan yon koub estanda yon sèl se apeprè 2 fwa (95% entèval konfyans, minimòm ak maksimòm), ki ka varyab ki pi piti a ki ka espere.

Pwodwi ki gen rapò:

Twous Cell Direct RT qPCR

Mouse Tail Direct PCR twous

Animal Tissus Direct PCR twous