RT-qPCR devlope nan teknoloji PCR òdinè.Li ajoute pwodui chimik fliyoresan (koloran fliyoresan oswa sond fliyoresan) nan sistèm reyaksyon PCR tradisyonèl la, epi li detekte pwosesis rkwir ak ekstansyon PCR an tan reyèl dapre diferan mekanis luminesan yo.Chanjman siyal fliyoresan nan mwayen an yo itilize pou kalkile kantite chanjman pwodwi nan chak sik PCR.Kounye a, metòd ki pi komen yo se metòd lank fliyoresan ak metòd sonde.

Metòd lank fliyoresan:
Gen kèk koloran fliyoresan, tankou SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, elatriye, pa emèt limyè poukont yo, men emèt fliyoresan apre yo fin mare groove a minè nan dsDNA.Se poutèt sa, nan kòmansman an nan reyaksyon an PCR, machin nan pa ka detekte siyal la fliyoresan.Lè reyaksyon an kontinye nan annealing-ektansyon (metòd de etap) oswa etap ekstansyon (metòd twa etap), seksyon doub yo louvri nan moman sa a, ak nouvo ADN polymerase a Pandan sentèz strand, molekil fliyoresan yo konbine nan groove a minè dsDNA ak emèt fliyoresans.Kòm kantite sik PCR ogmante, pi plis ak plis koloran konbine avèk dsDNA, epi siyal fliyoresan an tou kontinyèlman amelyore.Pran SYBR Green Ⅰ kòm yon egzanp.
Metòd sonde:
Sond Taqman se sond idwoliz ki pi souvan itilize.Gen yon gwoup fliyoresan nan fen 5′ nan sond la, anjeneral, FAM.Pwofonde nan tèt li se yon sekans konplemantè jèn sib la.Gen yon gwoup fliyoresan asouvisman nan fen 3' nan fluorophore la.Dapre prensip transfè enèji resonans fluoresans (Förster resonance enèji transfè, FRET), lè gwoup fluorescent repòtè a (donatè molekil fluorescent) ak gwoup fluorescent trempe (molekil fluorescent aseptè) Lè spectre eksitasyon an sipèpoze ak distans la trè pre (7-10nm), eksitasyon an nan molekil la fliyoresan asepte donatè a fluorescent molekil. ap febli.Se poutèt sa, nan kòmansman an nan reyaksyon an PCR, lè pwofonde a gratis ak entak nan sistèm nan, gwoup la fliyoresan repòtè pa pral emèt fliyoresans.Lè rkwit, primè a ak pwofonde mare nan modèl la.Pandan etap ekstansyon an, polymerase a kontinyèlman sentèz nouvo chenn.ADN polymerase gen 5′-3′ aktivite eksonukleaz.Lè rive nan pwofonde, ADN polymerase a pral idrolize pwofonde a soti nan modèl la, separe gwoup la fliyoresan repòtè ak gwoup la fliyoresan quencher, epi lage siyal la fliyoresan.Depi gen yon relasyon youn-a-yon ant pwofonde a ak modèl la, metòd pwofonde a siperyè metòd koloran an tèm de presizyon ak sansiblite tès la.

Fig 1 Prensip qRT-PCR

Premye konsepsyon
Prensip:

Jadendanfan yo ta dwe fèt nan rejyon an konsève nan seri asid nikleyik epi yo gen espesifik.

Li pi bon pou itilize sekans cDNA, ak sekans mRNA akseptab tou.Si ou pa, chèche konnen konsepsyon rejyon CDs nan sekans ADN la.
Longè a nan pwodwi fliyoresan quantitative a se 80-150bp, pi long la se 300bp, longè a Jadendanfan se jeneralman ant 17-25 baz, ak diferans ki genyen ant primè yo en ak en pa ta dwe twò gwo.

Kontni G + C a se ant 40% ak 60%, ak 45-55% se pi bon an.
Valè TM a se ant 58-62 degre.
Eseye evite primè dimers ak pwòp tèt ou-dimers, (pa parèt plis pase 4 pè baz konplemantè konsekitif) estrikti epengl, si inevitab, fè ΔG<4.5kJ/mol* Si ou pa ka asire ke gDNA yo te retire pandan transcription ranvèse Netwaye, li pi bon pou konsepsyon primè yo nan entron *3′ fen pou fè pou evite estrikti AT, 2, GC / rich pa ka modifye, 2, GC / GC. 3) primè ak non-
spesifik Omoloji a nan sekans heterogeneously anplifye a se de preferans mwens pase 70% oswa gen 8 konplemantè baz omoloji.
Baz done:
CottonFGD rechèch pa mo kle
Premye konsepsyon:
IDT-qPCR konsepsyon Jadendanfan

Fig2 IDT sou entènèt Jadendanfan konsepsyon zouti paj

Fig3 rezilta paj ekspozisyon
Konsepsyon primè lncRNA:
lncRNA:menm etap yo ak mRNA.
miRNA:Prensip metòd tij-bouk la: Depi tout miRNA yo se sekans kout apeprè 23 nt, deteksyon PCR dirèk pa ka fèt, kidonk yo itilize zouti sekans tij-bouk la.Sekans tij-bouk la se yon ADN ki gen yon sèl-cheche anviwon 50 nt, ki ka fòme yon estrikti epengl pou kont li.3 'Fen an ka fèt kòm yon sekans konplemantè nan fragman an pasyèl miRNA, Lè sa a, miRNA sib la ka konekte ak sekans nan tij-bouk pandan transcription ranvèse, ak longè total la ka rive nan 70bp, ki se nan liy ak longè a nan pwodwi a anplifye detèmine pa qPCR.Tailing miRNA Jadendanfan konsepsyon .
Anplifikasyon-espesifik deteksyon:
Sou entènèt baz done eksplozyon: eksplozyon CottonFGD pa resanblans sekans
Eksplozyon lokal: Gade lè l sèvi avèk Blast + pou fè eksplozyon lokal, linux ak macos ka dirèkteman etabli yon baz done lokal, sistèm win10 ka fè tou apre enstale ubuntu bash.Kreye baz done eksplozyon lokal yo ak eksplozyon lokal yo;louvri ubuntu bash sou win10.
Avi: Koton Upland ak koton zile lanmè yo se rekòt tetraploid, kidonk rezilta eksplozyon an pral souvan de oswa plis alimèt.Nan tan lontan an, lè l sèvi avèk CD NAU kòm yon baz done pou fè eksplozyon gen chans rive nan jwenn de jèn omològ ak sèlman kèk diferans SNP.Anjeneral, de jèn omològ yo pa ka separe pa konsepsyon primè, kidonk yo trete yo menm jan an.Si gen yon endel evidan, se Jadendanfan an anjeneral fèt sou endel la, men sa ka mennen nan estrikti segondè nan Jadendanfan an Enèji gratis la vin pi wo, ki mennen nan yon diminisyon nan efikasite anplifikasyon, men sa a se inevitab.

Deteksyon estrikti segondè primè:
Etap:louvri oligo 7 → antre sekans modèl → fèmen sub-fenèt → sove → lokalize Jadendanfan sou modèl, peze ctrl + D pou mete longè Jadendanfan → analize divès kalite estrikti segondè, tankou kò oto-dimerizasyon, heterodimer, epengl, dezakò, elatriye. De dènye foto yo nan Figi 4 yo se rezilta tès yo nan primè yo.Rezilta a nan Jadendanfan devan an se yon bon bagay, pa gen okenn dimer evidan ak estrikti epengl, pa gen okenn baz kontinyèl konplemantè, ak valè absoli nan enèji gratis se mwens pase 4.5, pandan y ap Jadendanfan an tounen montre kontinyèl 6 baz yo konplemantè, ak enèji a gratis se 8.8;nplis de sa, yon dimè ki pi grav parèt nan fen 3′, ak yon dim nan 4 baz youn apre lòt parèt.Malgre ke enèji gratis la pa wo, 3 'dimè Chl a ka seryezman afekte spesifik anplifikasyon ak efikasite anplifikasyon.Anplis de sa, li nesesè yo tcheke pou epengl, heterodimers, ak dezakò.

Fig3 oligo7 rezilta deteksyon
Deteksyon efikasite anplifikasyon:
Efikasite anplifikasyon reyaksyon PCR afekte rezilta PCR yo.Epitou nan qRT-PCR, efikasite anplifikasyon an patikilyèman enpòtan pou rezilta quantitative yo.Retire lòt sibstans, machin ak pwotokòl nan tanpon reyaksyon an.Kalite primè yo tou gen yon gwo enfliyans sou efikasite anplifikasyon qRT-PCR.Yo nan lòd yo asire presizyon nan rezilta yo, tou de quantification fluoresans relatif la ak quantification fluoresans absoli bezwen detekte efikasite anplifikasyon primè yo.Li rekonèt ke efikasite anplifikasyon qRT-PCR efikas se ant 85% ak 115%.Gen de metòd:
1. Metòd koub estanda:
a.Melanje cDNA
b.Dilution gradyan
c.qPCR
d.Ekwasyon regression lineyè pou kalkile efikasite anplifikasyon
2. LinRegPCR
LinRegPCR se yon pwogram pou analiz done RT-PCR an tan reyèl, ki rele tou done PCR quantitative (qPCR) ki baze sou SYBR Green oswa chimi menm jan an.Pwogram nan sèvi ak done ki pa korije debaz, fè yon koreksyon debaz sou chak echantiyon Separeman, detèmine yon fenèt-of-linearite ak Lè sa a, sèvi ak analiz regression lineyè pou anfòm yon liy dwat atravè seri done PCR la.Soti nan pant liy sa a yo kalkile efikasite PCR chak echantiyon endividyèl.Yo itilize efikasite PCR an mwayèn pou chak anplikon ak valè Ct pou chak echantiyon pou kalkile yon konsantrasyon kòmanse pou chak echantiyon, ki eksprime nan inite fliyoresans abitrè.Done antre ak pwodiksyon yo atravè yon calcul Excel.Sèlman echantiyon
melanje obligatwa, pa gen gradyan
etap yo obligatwa:(Pran Bole CFX96 kòm yon egzanp, pa byen machin ak ABI klè)
eksperyans:li se yon eksperyans qPCR estanda.
pwodiksyon done qPCR:LinRegPCR ka rekonèt de fòm fichye pwodiksyon: RDML oswa rezilta anplifikasyon quantification.An reyalite, li se valè deteksyon an tan reyèl nan nimewo sik la ak siyal fliyoresans pa machin nan, ak anplifikasyon an jwenn nan analize valè a chanjman fluoresans nan efikasite nan segman lineyè.
Seleksyon done: Nan teyori, valè RDML ta dwe ka itilize.Li estime ke pwoblèm nan nan òdinatè mwen an se ke lojisyèl an pa ka rekonèt RDML, kidonk mwen gen valè a pwodiksyon excel kòm done orijinal yo.Li rekòmande pou fè yon tès depistaj ki graj nan done yo an premye, tankou echèk nan ajoute echantiyon, elatriye Pwen yo ka efase nan done yo pwodiksyon (nan kou, ou pa ka efase yo, LinRegPCR pral inyore pwen sa yo nan etap la pita)

Fig5 qPCR done ekspòtasyon

Fig6 seleksyon echantiyon kandida yo

Done antre:Louvri rezilta anplifikasyon kalifikasyon.xls, → louvri LinRegPCR → fichye → li soti nan excel → chwazi paramèt jan yo montre nan Figi 7 → OK → klike sou detèmine liy debaz yo

Fig7 etap nan antre done linRegPCR

Rezilta:Si pa gen repetisyon, pa gen okenn gwoupman obligatwa.Si gen repetisyon, gwoupman an ka modifye nan gwoup echantiyon an, epi non jèn nan antre nan idantifyan an, epi yo pral otomatikman gwoupe menm jèn nan.Finalman, klike sou dosye a, ekspòte excel, epi gade rezilta yo.Efikasite anplifikasyon ak rezilta R2 chak pi ap parèt.Dezyèmman, si ou divize an gwoup, efikasite anplifikasyon mwayèn korije yo pral parèt.Asire ke efikasite anplifikasyon chak primè se ant 85% ak 115%.Si li twò gwo oswa twò piti, sa vle di ke efikasite anplifikasyon nan Jadendanfan an se pòv.

Fig 8 rezilta ak pwodiksyon done

Pwosesis eksperimantal:
Kondisyon kalite RNA:
Pite:1.72.0 endike ke ka gen rezidyèl isothiocyanate.Netwaye asid nikleyik A260 / A230 ta dwe alantou 2 .Si gen yon absòpsyon fò nan 230 nm, li endike ke gen konpoze òganik tankou iyon fenat.Anplis de sa, li ka detekte pa elektwoforèz jèl agarose 1.5%.Montre makè a, paske ssRNA a pa gen okenn denaturasyon ak logaritm pwa molekilè a pa gen yon relasyon lineyè, epi pwa molekilè a pa ka eksprime kòrèkteman.Konsantrasyon: Teyorikmanpamwens pase 100ng / ul, si konsantrasyon an twò ba, pite a jeneralman ba pa wo

Fig9 RNA jèl

Anplis de sa, si echantiyon an gen anpil valè ak konsantrasyon RNA a wo, li rekòmande pou aliquot li apre ekstraksyon, epi delye RNA a nan yon konsantrasyon final 100-300ng / ul pou transcription ranvèse.Nanpwosesis transkripsyon ranvèse, lè mRNA transkri, oligo (dt) primè ki ka espesyalman mare nan polyA ke yo itilize pou transkripsyon ranvèse, pandan y ap lncRNA ak circRNA itilize primè hexamer o aza (Random 6 mer) pou transkripsyon ranvèse nan RNA total Pou miRNA, miRNA-espesifik kou-bouk primè yo itilize pou transcription ranvèse.Anpil konpayi yo kounye a te lanse twous espesyal tailing.Pou metòd la tij-bouk, metòd la tailing se pi pratik, gwo-debi, ak reyaktif-ekonomize, men efè a nan distenge miRNAs nan menm fanmi an pa ta dwe osi bon ke metòd la tij-bouk.Chak twous transkripsyon ranvèse gen egzijans pou konsantrasyon primè espesifik jèn yo (bouk-tij).Referans entèn yo itilize pou miRNA se U6.Nan pwosesis envèrsyon tij-bouk, yo ta dwe ranvèse yon tib U6 separeman, epi yo ta dwe ajoute primè devan ak dèyè U6 dirèkteman.Tou de circRNA ak lncRNA ka itilize HKG kòm referans entèn yo.Nandeteksyon cDNA,
si pa gen okenn pwoblèm ak RNA, cDNA ta dwe tou bon.Sepandan, si pèfeksyon eksperyans lan pouswiv, li pi bon pou itilize yon jèn referans entèn (Jèn referans, RG) ki ka fè distenksyon ant gDNA ak CD.Anjeneral, RG se yon jèn nan kay., HKG) jan yo montre nan Figi 10;Lè sa a, mwen te fè pwoteyin depo soya, epi mwen te itilize actin7 ki gen entron kòm yon referans entèn.Gwosè fragman anplifye Jadendanfan sa a nan gDNA te 452bp, epi si cDNA te itilize kòm yon modèl, li te 142bp.Lè sa a, rezilta tès yo te jwenn ke Pati nan cDNA a te aktyèlman kontamine pa gDNA, epi li tou pwouve ke pa te gen okenn pwoblèm ak rezilta a nan transcription ranvèse, epi li te kapab itilize kòm yon modèl pou PCR.Li se initil kouri elektwoforèz jèl agarose dirèkteman ak cDNA, epi li se yon bann difize, ki pa konvenk.

Fig 10 deteksyon cDNA

Detèminasyon kondisyon qPCRse jeneralman pa gen pwoblèm dapre pwotokòl la nan twous la, sitou nan etap la nan valè tm.Si kèk primè yo pa byen fèt pandan konsepsyon primè, sa ki lakòz yon gwo diferans ant valè tm ak 60 °C teyorik la, li rekòmande ke cDNA a Apre echantiyon yo fin melanje, kouri yon PCR gradyan ak primè, epi eseye evite mete tanperati a san gwoup kòm valè TM.

Analiz done

Metòd pwosesis konvansyonèl fluoresans quantitative PCR se fondamantalman dapre 2-ΔΔCT.Modèl tretman done.

Pwodwi ki gen rapò:

An tan reyèl PCR fasil^TM – Taqman

An tan reyèl PCR fasil^TM –SYBR GREEN I

RT Easy I (Mèt Premix pou premye sentèz cDNA)

RT Easy II (Mèt Premix pou premye seksyon cDNA sentèz pou qPCR)