Esterilizasyon pwent pipèt ak tib EP, elatriye.

1. Prepare 0.1% (yon milyèm) DEPC (sibstans ki trè toksik) ak dlo deyonize, sèvi ak li ak anpil atansyon nan yon hotte lafimen, epi estoke li nan 4 ° C lwen limyè;

Dlo DEPC se dlo pi bon kalite trete ak DEPC ak esterilize pa tanperati ki wo ak presyon ki wo.Teste pou yo pa gen RNase, DNase ak proteinaz.

2. Mete pwent pipèt la ak tib EP nan 0.1% DEPC, epi asire ke pwent pipèt la ak tib EP yo plen ak 0.1% DEP.

3. Pwoteje kont limyè, kite kanpe, lannwit lan (12-24h)

4. Bwat la ki genyen pwent ak tib EP a pa bezwen tranpe nan DEPC.Apre ou fin retire dlo DEPC nan pwent oswa tib EP a, pake li epi vlope li.

5. 121 degre Sèlsiyis, 30min

6. 180 degre Sèlsiyis, sèk pou plizyè èdtan (omwen 3 èdtan)

Nòt: a.Mete gan an latèks ak mask lè w ap manyen DEPC!b, oswa san esterilizasyon DEPC, 130 ℃, 90min otoklav (anpil laboratwa esterilizasyon tanperati wo de fwa)

Konsiderasyon ekstraksyon RNA

De gwo fenomèn nan echèk izolasyon RNA tisi

Degradasyon RNA ak rezidi enpurte nan tisi yo,konsènan degradasyon, ann premye gade poukisa RNA ekstrè nan selil kiltive yo pa fasil degrade.Reyaktif ekstraksyon RNA ki deja egziste yo tout gen eleman ki rapidman anpeche RNase.Ajoute lysate la nan selil kiltive yo, epi tou senpleman melanje li, tout selil yo ka byen melanje ak lysate la, epi selil yo konplètman lysed.Apre selil yo lysed, engredyan aktif nan lysate la imedyatman anpeche RNase entraselilè a, kidonk RNA a rete entak.Sa vle di, paske selil kiltive yo fasil epi konplètman kontakte lisat la, RNA yo pa fasil degrade;an lòt men an, RNA a nan tisi a fasil degrade paske selil yo nan tisi a pa fasil pou byen vit kontakte lysate la.akòz kontak ase.Se konsa,sipoze gen yon fason yo vire tisi a nan yon sèl selil pandan y ap anpeche aktivite RNA, pwoblèm nan nan degradasyon ta ka konplètman rezoud.

Fraisage nitwojèn likid se metòd sa yo ki pi efikas.Sepandan, metòd fraisage nitwojèn likid la trè anbarasman, espesyalman lè kantite echantiyon yo gwo.Sa a te bay monte pwochen pi bon bagay la: homogenizer la.Lahomogenizermetòd pa konsidere kesyon an sou ki jan aktivite RNase inibit anvan selil yo kontakte ak lysate la, men pito priye ke pousantaj la nan dezòd tisi se pi vit pase pousantaj la nan ki entraselilè RNase degrade RN.

Efè homogenizer elektrik la pi bon,ak efè a nan homogenizer vè se pòv, men an jeneral, metòd la homogenizer pa ka anpeche fenomèn nan degradasyon.Se poutèt sa, si ekstraksyon an degrade, yo ta dwe itilize orijinal homogenizer elektrik la pou fanm k'ap pile ak nitwojèn likid;yo ta dwe chanje omojenize vè orijinal la nan yon homogenizer elektrik oswa dirèkteman moulen ak nitwojèn likid.Pwoblèm lan se prèske 100% posib.jwenn rezoud.

Pwoblèm nan rezidi enpurte ki afekte eksperyans ki vin apre gen plis kòz divès pase degradasyon, ak solisyon yo korespondan diferan.An konklizyon,si gen degradasyon oswa enpurte rezidyèl nan tisi a, yo dwe optimize metòd ekstraksyon / reyaktif pou materyèl espesifik eksperimantal la.Ou pa bezwen sèvi ak echantiyon presye ou yo pou optimize: ou ka achte kèk ti bèt tankou pwason / poul nan mache a, pran pati ki koresponn nan materyèl la pou fè ekstraksyon RNA, ak lòt pati a pou fè ekstraksyon pwoteyin - moulen ak bouch, lestomak ak entesten ekstrè.

RNA sib la nan RNA extrait yo itilize pou diferan eksperyans swivi, ak kondisyon kalite li yo diferan

Konstriksyon bibliyotèk cDNA mande pou entegrite RNA san rezidi inibitè reyaksyon anzim;Northern mande pou pi wo entegrite RNA ak pi ba kondisyon pou résidus inhibiteurs reyaksyon anzim;RT-PCR pa mande pou entegrite RNA twò wo,men inibit reyaksyon anzim yo.Kondisyon pou rezidi yo sevè.Antre a detèmine pwodiksyon an;chak fwa objektif la se jwenn pite RNA ki pi wo a, li pral koute pèp la ak lajan.

Koleksyon/Depo echantiyon yo genyen

Faktè ki afekte degradasyon Apre echantiyon an kite kò vivan an/oswa anviwònman kwasans orijinal la, anzim andojèn nan echantiyon an ap kòmanse degrade RNA,ak pousantaj degradasyon an ki gen rapò ak kontni an nan anzim andojèn ak tanperati.Tradisyonèlman, gen sèlman de fason yo konplètman anpeche aktivite anzim andojèn: ajoute lysate imedyatman epi omojeneize byen ak rapidman;koupe an ti moso epi imedyatman friz nan nitwojèn likid.Tou de apwòch mande pou operasyon rapid.Lèt la se apwopriye pou tout echantiyon, pandan y ap ansyen an se sèlman apwopriye pou tisi ki gen kontni ki ba nan selil ak anzim andojèn ak pi fasil omojeneize.Espesyalman, tisi plant, fwa, tim, pankreyas, larat, sèvo, grès, tisi nan misk, elatriye yo pi byen jele ak nitwojèn likid anvan ou kontinye.

Fragmantasyon ak omojenizasyon echantiyon yo

Faktè ki afekte degradasyon ak rannman Fragmantasyon echantiyon sepou omojènize bon jan, ki se pou lage konplè epi konplè RNA.Selil yo ka omojènize dirèkteman san yo pa kase.Tisi yo ka omojeneize sèlman apre yo fin kase.Leven ak bakteri yo bezwen kase ak anzim korespondan anvan yo ka omojeneize.Tisi ki gen pi ba kontni anzim andojèn ak omojènizasyon pi fasil yo ka kraze ak omojeneize nan yon sèl fwa nan lysate la pa yon omojèn;tisi plant, fwa, tim, pankreyas, larat, sèvo, grès, tisi nan misk ak lòt echantiyon yo, yo swa gen anpil anzim andojèn oswa yo pa fasil omojènize,se konsa dezòd tisi ak omojenizasyon dwe fèt separeman.Metòd ki pi serye ak pi pwodiktif nan fwagmantasyon se fraisage ak nitwojèn likid, ak metòd ki pi serye nan omojènize se itilize nan yon homogenizer elektrik.Yon nòt espesyal sou fraisage ak nitwojèn likid: echantiyon an pa dwe dekonjle pandan tout pwosesis fraisage a, paske anzim andojèn yo gen plis chans pou yo fonksyone lè yo nan frizè.

Chwa nan lysate

Ki afekte konvenyans nan operasyon ak faktè sa yo nan enpurte rezidyèl andojèn Solisyon yo souvan itilize lysis ka prèske anpeche aktivite a nan RNase.Se poutèt sa, pwen kle nan chwazi yon solisyon lysis se konsidere nan konbinezon ak metòd la pou pirifye.Gen yon sèl eksepsyon:echantiyon ki gen gwo kontni anzim andojèn yo rekòmande yo sèvi ak yon lysate ki gen fenol ogmante kapasite nan inaktive anzim andojèn.

Chwa metòd pou pirifye

Faktè ki afekte rezidyèl enpurte andojèn, vitès ekstraksyon Pou echantiyon pwòp tankou selil yo, rezilta satisfezan ka jwenn ak prèske nenpòt metòd pou pirifye nan men yo.Men, pou anpil lòt echantiyon, espesyalman moun ki gen nivo segondè nan enpurte tankou plant, fwa, bakteri, elatriye, chwazi yon metòd pou pirifye apwopriye enpòtan.Metòd pou pirifye santrifujeur kolòn lan gen yon vitès ekstraksyon rapid epi li ka efektivman retire enpurte ki afekte reyaksyon anzimatik ki vin apre nan RNA, men li chè (Foregene ka ofri twous pri-efikas, plis detay klike souisit la);lè l sèvi avèk metòd pou pirifye ekonomik ak klasik, tankou presipitasyon LiCl, ka jwenn rezilta satisfezan tou, men tan operasyon an long..

"Twa disiplin ak uit atansyon" pou fè ekstraksyon RNA

Disiplin 1:Mete yon fen nan kontaminasyon an nan anzim ekzojèn.

Nòt 1:Fè egzateman mete mask ak gan.

Nòt 2:Tib santrifujeur yo, tèt pwent, baton pipèt, tank elektwoforèz, ak ban eksperimantal ki enplike nan eksperyans la ta dwe byen jete.

Nòt 3:Reyaktif/solisyon ki enplike nan eksperyans la, espesyalman dlo, dwe san RNase.

Disiplin 2:Bloke aktivite anzim andojèn yo

Nòt 4:Chwazi yon metòd omojèn ki apwopriye.

Nòt 5:Chwazi yon lysate ki apwopriye.

Nòt 6:Kontwole kantite lajan an kòmanse nan echantiyon an.

Disiplin 3:Klarifye objektif ekstraksyon ou

Nòt 7:Avèk nenpòt sistèm lysate ki apwoche kantite maksimòm echantiyon an, pousantaj siksè ekstraksyon an bese sevè.

Nòt 8:Sèl kritè ekonomik pou ekstraksyon RNA siksè se yon siksè nan eksperyans ki vin apre, pa sede.

Top 10 Sous Kontaminasyon RNase

1. Dwèt yo se premye sous anzim ekzojèn, kidonk gan yo dwe mete ak ranplase souvan.Anplis de sa, mask yo dwe mete tou, paske respire se tou yon sous enpòtan nan anzim.Yon benefis adisyonèl nan mete yon mask gan se pwoteje eksperimantè a.

2. Pwent pipèt, tib santrifij, pipèt - RNase pa ka inaktive pa esterilizasyon pou kont li, kidonk pwent pipèt ak tib santrifij yo ta dwe trete ak DEPC, menm si yo make kòm DEPC trete.Li pi bon pou sèvi ak yon pipèt espesyal, siye li ak yon boul koton 75% alkòl anvan ou itilize, espesyalman baton an;nplis de sa, asire w ke ou pa sèvi ak yon retire tèt.

3. Dlo/tanpon an dwe san kontaminasyon RNase.

4. Omwen tab tès la ta dwe siye pwòp ak 75% boul koton alkòl.

5.Endogenous RNase Tout tisi yo gen anzim andojèn, kidonk konjelasyon rapid nan tisi ak nitwojèn likid se pi bon fason pou diminye degradasyon.Metòd depo / fanm k'ap pile nitwojèn likid la se vre konvenyan, men li se sèl fason pou tisi ki gen nivo segondè nan anzim andojèn.

6. Echantiyon RNA Pwodui ekstraksyon RNA ka genyen tras kontaminasyon RNase.

7. Ekstraksyon Plasmid Ekstraksyon Plasmid souvan itilize Rnase pou degrade RNA, epi Rnase rezidyèl la ta dwe dijere ak Proteinase K epi ekstrè pa PCI.

8. Depo RNA Menm si li estoke nan tanperati ki ba, tras kantite RNase ap lakòz degradasyon RNA.Pi bon solisyon pou prezèvasyon alontèm nan RNA se yon sispansyon sèl / alkòl, paske alkòl inibit tout aktivite anzimatik nan tanperati ki ba.

9. Lè kasyon (Ca, Mg) gen iyon sa yo, chofaj nan 80C pou 5 minit ap lakòz RNA dwe clived, kidonk si RNA bezwen chofe, solisyon an prezèvasyon bezwen genyen yon ajan chelating (1mM Sodyòm Sitrat, pH 6.4).

10. RNase ka kontamine anzim yo itilize nan eksperyans ki vin apre yo.

10 Konsèy pou fè ekstraksyon RNA

1: Byen vit anpeche aktivite RNase.Echantiyon yo byen vit jele apre koleksyon, epi RNase inaktive pa operasyon rapid pandan liz.

2: Chwazi yon metòd ekstraksyon apwopriye pou tisi ki gen gwo kontni ribozim, ak tisi adipoz pi bon pou itilize metòd ki gen fenol.

3: bon jan kalite prediksyon mande pou Northern, konstriksyon bibliyotèk cDNA mande pou entegrite segondè, ak RT-PCR ak RPA (essay pwoteksyon Ribonuclease) pa mande pou entegrite segondè.RT-PCR mande pou pite segondè (résid inhibiteur anzim).

4: Omojènize bon jan se kle nan amelyore sede ak diminye degradasyon.

5: Tcheke entegrite deteksyon elektwoforèz RNA, 28S: 18S = 2: 1 se yon siy konplè, 1: 1 akseptab tou pou pifò eksperyans.

6: Retire ADN pou RT-PCR, analiz etalaj Li pi bon pou itilize Dnase I pou retire ADN.

7: Diminye kontaminasyon an nan anzim ekzojèn - anzim yo pa ka enpòte soti nan deyò.

8: Lè konsantre asid nikleyik ba konsantrasyon, yo ta dwe ajoute yon reyaktif ko-presipitasyon.Men, pou anpeche ko-precipitant ki gen anzim ak kontaminasyon ADN.

9: byen fonn RNA a, si sa nesesè, chofe a 65C pou 5 minit.

metòd depo apwopriye

Li ka estoke nan -20C pou yon ti tan, ak nan -80C pou yon tan long.Premye etap la nan amelyore pwodiksyon RNA se reyalize ke kontni an RNA nan echantiyon diferan varye anpil.Gwo abondans (2-4ug/mg) tankou fwa, pankreyas, kè, mwayen abondans (0.05-2ug/mg) tankou sèvo, anbriyon, ren, poumon, tim, òvèj, ba abondans (<0.05ug/mg) mg) tankou nan blad pipi, zo, grès.

1: Lyse selil yo pou yo lage RN - si RNA pa lage, pwodiksyon an ap redwi.Omojènizasyon elektrik travay pi byen pase lòt metòd omojènizasyon, men li ka bezwen tou konbine avèk lòt metòd, tankou likid nitwojèn mashing, dijesyon anzimatik (Lysozyme / Lyticase)

2: Optimizasyon metòd ekstraksyon an.Pi gwo pwoblèm ak metòd ki baze sou fenol yo se stratifikasyon enkonplè ak pèt pasyèl RNA (sipènatant la pa ka konplètman retire).Stratifikasyon enkonplè se akòz gwo asid nikleyik ak kontni pwoteyin, ki ka rezoud lè yo ogmante kantite lisat yo itilize oswa diminye kantite echantiyon an.Yon etap nan fè ekstraksyon klowofòm te ajoute nan tisi adipoz la.Pèt RNA ka redwi pa tounen-ponpe oswa lè w retire kouch òganik la ki te swiv pa santrifujasyon.Pwoblèm nan pi gwo ak metòd santrifujasyon kolòn ki baze sou se echantiyon depase.

Konsèy ekstraksyon klasik

1. Phenol pou pirifye: Ajoute yon volim egal nan 1:1 Phenol / Chloroform epi melanje kouray pou 1-2 minit.Santrifije nan gwo vitès pou 2 minit.Ak anpil atansyon retire supernatant la (80-90%).Pa janm rive nan kouch mitan an.Yo ka ajoute yon volim egal nan solisyon reyaksyon an nan fenol/klowofòm epi retire supernatant la.De supernatant yo ka melanje ansanm pou presipitasyon asid nikleyik amelyore sede a.Pa twò dou lè melanje, epi pa eseye retire tout supernatant la.

2. Lave ak etanòl 70-80%: Pandan lave, asid nikleyik la dwe sispann pou asire ke sèl rezidyèl la lave.An menm tan an, imedyatman apre vide etanòl la, santrifije nan gwo vitès pou kèk segonn, ak Lè sa a, retire etanòl la rezidyèl ak yon pipèt.Fonn apre kanpe nan tanperati chanm pou 5-10 minit.

11. Ekstraksyon òganizasyon espesyal

1. Tisi fib: kle nan fè ekstraksyon RNA nan tisi fib tankou kè / misk skelèt se konplètman deranje tisi a.Tisi sa yo gen dansite selil ki ba, kidonk kantite RNA pou chak pwa inite tisi a ba, epi li pi bon pou itilize kantite lajan demaraj posib.Asire ou ke ou moulen tisi a byen nan kondisyon lè w konjele.

2. Tisi ki gen gwo kontni pwoteyin / grès: kontni grès nan sèvo / legim se wo.Apre ekstraksyon PCI, supernatant la gen flokil blan.Supernatant la dwe re-extrait ak klowofòm.

3. Tisi ki gen gwo kontni asid nikleyik / ribozim: larat / timis la gen gwo asid nikleyik ak kontni ribozym.Manje tisi anba kondisyon konjelasyon ki te swiv pa omojenizasyon rapid ka efektivman inaktive ribozymes.Sepandan, si lysate a twò gluan (akòz kontni segondè asid nikleyik), ekstraksyon PCI a pa pral kapab stratifye efektivman;ajoute plis lysate ka rezoud pwoblèm sa a.Ekstraksyon miltip PCI ka retire plis ADN rezidyèl.Si yon presipite blan fòme imedyatman apre yo fin ajoute alkòl, li endike kontaminasyon ADN.Re-ekstraksyon ak PCI asid apre yap divòse ka retire kontaminasyon ADN.

4. Tisi plant: Tisi plant yo pi konplèks pase tisi bèt.Anjeneral, plant yo tè anba kondisyon nitwojèn likid, kidonk degradasyon RNA pa anzim andojèn pa komen.Si pwoblèm degradasyon an pa rezoud, li se prèske sètènman ki te koze pa enpurte ki genyen nan echantiyon an.Enpurte ki genyen nan anpil plant ap mennen nan résidus, ak rezon ki fè yo pou résidus se souvan paske enpurte sa yo gen kèk resanblans ak RNA: ou presipite ak mwen presipite, epi ou adsorbe epi mwen adsorb.Karakteristik sa yo detèmine ke yo trè fò inibitè anzim.

Kounye a, reyaktif ekstraksyon RNA komèsyal yo ka adapte nan prèske tout tisi bèt ak ti ajisteman, men gen kèk reyaktif ekstraksyon RNA komèsyal ki ka apwopriye pou pifò tisi plant yo.Erezman, Foregene ka bay espesyaltwous ekstraksyon RNA plant yo, nou genyenTwous Izolasyon RNA Total Plant, Plant Total RNA Isolation kit Plus.Lèt la fèt espesyalman pou plant ki gen gwo kontni polisakarid ak polifenol.Pou fè ekstraksyon RNA, fidbak nan itilizatè laboratwa yo patikilyèman bon.

12. Efè echantiyon konjelasyon ak dekonjle echantiyon nan frizè a ka pi gwo, epi li bezwen koupe anvan yo itilize pou fè ekstraksyon RNA.Echantiyon yo gen tandans fonn (petèt pasyèlman) pandan koupe.Echantiyon jele yo ka bezwen peze anvan ekstraksyon RNA, epi dekonjle pral definitivman rive pandan pwosesis sa a.Pafwa, dekonjle echantiyon an rive tou pandan pwosesis fraisage nitwojèn likid la;oswa echantiyon nan frizè dirèkteman ajoute nan lysate la san yo pa fraisage nitwojèn likid, ak dekonjle pral definitivman rive anvan omojenizasyon konplè a.Eksperyans yo te montre ke tisi nan frizè gen plis tandans fè degradasyon RNA pandan dekonjle pase tisi fre.Rezon ki fè posib: Pwosesis friz-dekonjle deranje estrikti ki nan selil la, sa ki fè li pi fasil pou anzim andojèn yo vin an kontak dirèk ak RNA a.

13. Jijman kalite RNA Anjeneral, yo itilize elektwoforèz pou jije entegrite RNA, epi yo itilize A260/A280 pou jije pite RNA.Nan teyori, RNA entak gen yon rapò 28S:18S = 2.7:1, epi pifò done yo mete aksan sou rapò 28S:18S = 2:1.Reyalite a se ke prèske pa youn nan RNA ki ekstrè soti nan echantiyon lòt pase selil ki nan yon rapò 2: 1 (sa a te jwenn lè l sèvi avèk Agilent Bioanalyzer la).

Rezilta elektwoforèz RNA yo afekte pa anpil faktè, tankou estrikti segondè, kondisyon elektwoforèz, chaj echantiyon, degre saturation pa EB, elatriye. Sèvi ak elektwoforèz natif natal pou detekte RNA epi sèvi ak ADN Marker kòm yon kontwòl.Si 28S la nan 2kb ak 18S la nan 0.9kb yo klè, ak 28S: 18S > 1, entegrite a ka satisfè kondisyon ki nan pifò eksperyans ki vin apre yo.

A260/A280 se yon endikatè ki te lakòz anpil konfizyon.Premye a tout, li nesesè klarifye siyifikasyon orijinal la nan endikatè sa a pou asid nikleyik: pi RNA, A260/280 li yo = apeprè 2.0.Pi RNA se 'kòz' la ak A260/A280 = 2 se 'efè'.Koulye a, tout moun ap itilize A260/A280 kòm yon 'kòz', panse ke "si A260/A280 = 2, Lè sa a, RNA se pi", ki natirèlman mennen nan konfizyon.

Si w enterese, ou ka ajoute yon ti reyaktif ki souvan itilize nan ekstraksyon, tankou fenol, guanidine isothiocyanate, PEG, elatriye, nan echantiyon RNA ou a, ak Lè sa a, mezire rapò a A260 / A280.Reyalite a se ke anpil nan reyaktif yo itilize pou fè ekstraksyon RNA, osi byen ke anpil enpurte nan echantiyon an, absòbe alantou A260 ak A280, ki afekte A260 / A280.

Apwòch ki pi enstriksyon kounye a se eskane echantiyon RNA nan seri 200-300 nm.Koub nan RNA pi bon kalite gen karakteristik sa yo: koub la se lis, A230 ak A260 se de pwen enfleksyon, A300 se fèmen nan 0, A260 / A280 = alantou 2.0, ak A260 / A230 = alantou 2.0.Si done eskanè yo pa disponib, yo dwe detèmine rapò A260/A230 tou, paske rapò sa a pi sansib pou transfè tout enpurte ki afekte reyaksyon anzimatik la.Pran an kont ranje lineyè aparèy la (0.1-0.5 pou A260).

Gen de lòt fenomèn itil: rapò a pral apeprè 0.3 pi ba lè yo mezire A260 / A280 nan dlo;pandan y ap rapò a mezire nan 10 mM EDTA se apeprè 0.2 pi wo pase sa ki mezire nan 1 mM EDTA.

Pwodwi ki gen rapò:

Lachin Plant Total RNA Izolasyon Twous Manifakti ak founisè |Foregene (foreivd.com)

RNA seri izolasyon Founisè ak faktori |Lachin RNA seri izolasyon Konpayi fabrikasyon (foreivd.com)

Seri izolasyon RNA - Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)